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Técnicas de BM
Técnicas de la Biología Molecular
| Question | Answer |
|---|---|
| ¿Qué es la clonación? | Es una forma de reproducción asexual que requiere la intervención del hombre para llevarse a cabo. |
| ¿En qué consiste la clonación? | En la obtención de un clon, conjunto de elementos, moléculas, células, tejidos, órganos u organismos, generalmente idénticos entre sí y su precursor. |
| Clasificación de la clonación según su finalidad: | de organismos,de células, de moléculas. |
| En que se divide la clonacion de moléculas | acelular (PCR), celular (DNA recombinante) |
| Es le método clásico de clonación de ácidos nucleicos, es el que aprovecha la capacidad de las células para replicar el DNA | Clonación celular |
| Son enzimas con capacidad de escindir los enlaces fosfodiester de la cadena polinucleotídica de los acidos nucleicos. | Fosfodiesterasas , nucleasas |
| Criterios con los que se analiza la especificidad de las nucleasas: | escición en posiciones internas o terminales de la estructura primaria (exo y endonucleasas), actuan sobre uno de los dos tipos de enlaces fosfodiester (OH 3' y 5'), reconocimiento de nucleosidos |
| ¿Que son las enzimas de restricción? | Son endonucleasas que reconocen una secuencia de ADN e 4-8 pb. |
| Menciona otros nombres para las enzimas de restricción | nuclesas de restricción, endonucleasas de restricción y enzimas restrictivas- |
| ¿Como se nombran las enzimas de restricción? | con las 3 letras del género y especie de la bacteria y un número roma |
| ¿Porqué son importantes las enzimas de restricción? | Por su especificidad de reconocimiento de una secuencia de DNA dúplex e hidrólisis de enlace fosfodiéster , justo en secuencias llamadas: sitios de reconocimiento o restricción- |
| ¿Qué es el sitio de restricción? | Es el lugar de reconocimiento e hidrólisis |
| Acción de las enz de restricción del tipo II | se encargan de hidrolizar los enlaces fosfodiester del DNa, produciendo dos segmentos de restricción. |
| Diferencia entre las enz de restricción del tipo II y I y III | el tipo II requiere ATP, las otras no |
| El proceso de clonación celular se realiza in vivo | Verdadero |
| ¿En qué se basa el proceso de clonación celular? | En la realización de múltiples rondas de multiplicación, catalizadas por la DNa polimerasa propia de la célula anfitriona. |
| Fragmento de DNA o cena a clonar | Inserto |
| DNA al que se le unirá el inserto | vector de clonación |
| La molécula de DNA recombinante se incopora a la célula anfitriona donde tiene lugar la | amplificación por replicación |
| Una vez que detecta el DNA de interés y se seleccionan los clones que lo amplifican... | se aisla el gen o fragmento de DNA y cDNA |
| Procesos que ocurren en la etapa 1 o preparación del DNA para su clonación | parte de celulas nucleadas (sanguíneas), lisis de células y eliminación de células acompañantes, precipitación y concentración de DNA, fragmentación con eznzimas de restricción. aislamiento del fragmento. |
| Como se lleva a cabo la lisis de células y eliminación de células acompañantes (enz, RNA, proteínas) | por sonicación o suspensión en medio hipotónico. |
| como se lleva a cabo el aislamiento del fragmento | por electroforesis, centrifugacion por gradiente de densidad y HPLC. |
| Etapa 2 de la clonación | Preparación del vector de clonación |
| Características del vector | pequeña, fàcil de ailar y caracterizar, con secuencia y mapa de restricciòn,replicación independiente a la celula anfitriona, de facil introduccion a la celula enfitrion. |
| Misión del vector | Unirse al inserto para facilitar su entrada a cèlula anfitriona y replicaciòn |
| ¿como debe ser cortado el vector para ser unido con facilidad? | con las mismas enz de restricción, o con enz que proporcionen extremos compatibles |
| Los vectores pueden ser eucariotas y procariotas | verdadero |
| VEctores.moléculas de DNa con doble hebra, pequeñas, circulares, en el citrosol | plásmidos |
| Vectores. por su replicación, presentando una alta eficiencia de clonación, al modificarlos | virus, bacteriófagos |
| Vectores. PAra adapatrse al gran tamaño de insertos requeridos,y la clonación de cèlulas eucariotas | cromosomas artificiales |
| Vectores sintéticos que combinan características de plásmidos y fagos, útiles para clonar insectos de mayor tamaño | quimeras o cosmidos |
| Es la unión covalente in vitro del inserto de DNA al vector fragmentado, mediante una ligasa | Etapa 3. Formación de la molécula de DNA recombinante- |
| ¿De que depende la union? | del tipo de vectores que resulten de preparar el inserto y vector |
| ¿Como es la secuencia del DNa recombinante? | especifica de la enz de restricción empleada y se asocia con extremos compatibles |
| Etapa 4 de la clonación | Incorporación del DNa recombiante a la céula anfitriona |
| ¿porque se acude a varios metodos para la introduccion del rDNA a la celula anfitriona? | porque la permeabilidad de la emmbrana no permite la incorporación de grandes fragmentos de rDNA |
| Métodos de introducción del rDNA | Pasivos y activos |
| ¿Cuales son los metodos pasivos? | alteracion transitoria de la permeabilidad celular. Transformación: introducciòn en bacterias anfitrionas |
| ¿Cuàles son los métodos activos? | introducción del rDNA directamente. Tranfección: empleo de virus como vector. |
| Describir tratamiento para la introducción del rDNA | Tratamiento FQ.Se comienza con una incubación en presencia de CaCl2 a 0 °C, seguida de un cambio brusco a 37-43 °C, que induce a las bacterias a aceptar moléculas de DNA. Se dispone de cepas establecidas especialmente susceptibles a este proceso. |
| Otros métodos para introducir rDNA: | PEG, liposomas, vector vírico |
| Etapa 5 de la clonación | Propagación en cultivo |
| La división de células anfitrionas en cultivo producirá | copias del rDNA que haya podido incorporar , la clonación |
| ¿Como se lleva a cabo la división en cultivo? | se siembran en agar para que crezcan colonias, luego estas se transiferen a medio liquido. |
| ¿De qué depende que el DNA se replique de manera rápida e independiente? | de las propiedades del vector |
| Puede originarse en la creación del DNA recombinante una gran variedad, por lo que debe diferenciar e incorporar al DNA deseado. | Etapa 6. Detección y selección de clones recombinantes |
| Métodos de detección | hibridación, inmunoquímico, genéticos o de selección fenotípica. |
| Detección de una secuencia de DNA clonado, o del mRNA | Hibridación |
| detección de la proteína codificada por un gen clonado, mediante un Ac | Inmunoquímico |
| Detección y selección de genes marcadores en el vector. | geneticos o de seleccion fenotipica |
| etapa 7 de la clonacion | expresion genica |
| ¿Que se emplea para la expresion del gen? | vectores de expresión, especializados, que favorecen la transcripción de un gen incorporado a la célula anfitriona. |
| Un vector incluye... | un promotor |
| Es una colección de clones formados a partir de todos los clones del ADN, obtenidos por la escision de un genoma. | Genotecas |
| Aplicaciones de la ingenieria genetica | Producción de proteínas y enzimas. Eritropoyetina. Activador tisular del plasminogeno. Hormonas. Factor de crecimiento epidérmico. Hormona estimulante del folículo. Insulina. Vacunas. Hepatitis B. Sarampión. |
| Este tipo de clonación tiene una característica fundamental; es un tipo de reproducción asexual en donde se reproduce o se forma una copia de un organismo ya existente con la misma formación genética. | Clonación de organismos |
| Tipos de celuas que se encuentran en la clonacion de organismo | La primera de ellas es la que dona su material genético (ADN) y la segunda es la que lo recibe, siendo ésta un ovocito que se encuentra en su meiosis II en el citoplasma y a la cual se le han retirado sus cromosomas. |
| Que ocurre al comenzar el proceso de clonacion de organimso | mediante electrochoques se fusionan ambas células y estos mismos son los encargados de incitar al desarrollo de la nueva célula formada |
| luego... | esta es injertada en el útero de la hembra donde se le permite un ambiente apto para su crecimiento. |
| ¿Qué es DNA fingerprint (huella genética) | Conjunto de marcadores genéticos de DNA (STRs, polimorfismos) tipificados en un individuo. Identificación de una pequeña porción de nuestro ADN, que nos diferencia de otras personas menos de un hermano gemelo IDENTICO |
| Marcadores de fingerprints basados en proteínas | isoenzimas , proteínas de reserva |
| Marcadores de fingerprints basados en el DNA | RFLP, AFLP, RAPD, VNTR, SSR, SNP, STR, SFP |
| Grupo de múltiples formas moleculares de una misma enzima presente en una misma especie, como resultado de la presencia de uno o más genes que codifican cada una de estas formas. | Isoenzimas |
| Isoenzimas relevantes como marcadores genéticos | aloenzimas (o alozimas) que son variantes alélicas del mismo gen (o locus) y que presentan una migración electroforética diferencial. |
| Son codominantes, por lo tanto más informativos.Son altamente reproducibles Se pueden usar las mismas sondas en especies relacionadas (sondas heterólogas).Mapeo comparativo. Construcción de mapas genéticos. Análisis filogenético | RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) |
| Consiste en la amplificación mediante PCR de ADN anónimo, utilizando un único iniciador de secuencia arbitraria. Los primers se diseñan sin tener en cuenta información genómica de la especie a analizar. | RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs) |
| son marcadores genéticos dominantes.No permiten distinguir el heterocigota del homocigota dominante | Los RAPDs |
| Resulta de mutaciones de punto, inversiones,deleciones e inserciones que llevan a: Pérdida o ganancia de un sitio de restricción. Alteración de la secuencia reconocida por los iniciadores. | AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) |
| Son marcadores dominantes: no es posible distinguir si una banda en un gel es el resultado de la amplificación de uno o dos alelos. | AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) |
| Aplicaciones de AFLP | Estudios de diversidad genética. Establecimiento de genealogías (paternidad). Determinación de pureza híbrida. Mapeo de genes. |
| SNP (SINGLE NUCLOTIDE POLYMORPHISM). | variación existente en un solo par de bases . Son responsables de una gran variedad del genoma humano. , se hace posible la construcción de un mapa de SNPs, lo que se une a la utilidad propia para la determinación de enfermedades. |
| Describir téncica minisatelite | 10-65 pb, VNTR, muestras en buen estado, sangre, saliva, semen, etc |
| Descrbir tecnina microsatelite | menos de 7pb, ADN deteriorado o en pequeña cantidad, restos con material biologico |
| surge de la presencia de DNA repetitivo no codificante en eucariotas,DNA satélite,formado por unidades de pequeño tamaño (2-50 pb) repetidas millón de veces. | VNTR (VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS). |
| regiones altamente polimorficas compuestas por una secuencia de 2-7 pb que se repite en tandem, siendo, precisamente, la variación en el numero de veces que se repite la unidad de secuencia es la base de su polimorfismo genético (al igual que los VNTR). | STR(SHORT TANDEM REPEATS). |
| Aplicaciones de fingerprint | Resolución de casos criminales, Identificación de personas o sus restos,paternidad. Detección de enfermedades genéticas. Identificación de la procedencia de alimentos. Estudios evolutivos. Estudios históricos, antropología y paleontología. |
| PRUEBA DE PATERNIDAD. | Se comparan las huellas de la madre, del niño y del presunto padre. |
| ¿En qué se basa la ténnica del fingerprint? | en la técnina de southern para analizar regiones polimòrficas de DNA |
| Pasos de fingerprint | aislar, restricción, electroforesis, transferencia, desnaturalizaciòn, hibridación, detección. |
| enzima de restricción más utilizada | HaeIII que corta en las secuencias GGCC. |
| Los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño. | Electroforesis en gel de agarosa. |
| del ADN a una membrana de nylon (plástico). La membrana se apoya en el gel de electroforesis y se hace una copia o «calco» | Transferencia |
| Introducir marcadores radioactivos. Hasta el momento, los fragmentos de DNA no son visibles. Introducir una pequeña secuencia de ADN (sonda) marcada radioactivamente, esta se unirá de forma complementaria al DNA que esta en membrana de nylon | Hibridación de sonda. |
| ¿En que consiste la detección? | Autorradiografía de ADN. La membrana de nylon se pone junto con la película de rayos X que detecta donde hay marcadores radioactivos y se revela con una fotografía. |
| Es la probabilidad de no observar el perfil particular en una población de N individuos no relacionados. Se requiere que esta probabilidad sea mayor que o igual a un 1 - un nivel de confianza. | (1 - px)N |
| Es el proceso mediante el cual se determina el orden de nucleótidos de un fragmento dado de ADN | Secuenciación |
| La estrategia básica de la secuenciación de ácidos nucleicos involucra: | La degradación específica y el fraccionamiento de grandes polinucleótidos. Secuenciación de fragmentos pequeños, ordenamiento de fragmentos pequeños. |
| Avances que hicieron posible la secuanciación: | enzimas de restricción, técnicas de secuencoiación, técninas de clonación |
| Protocolos para la secuanciaciòn de DNA: | Quimico, Enzimatico |
| Metodo quimico | El primer método fue el de Maxam y Gilbert |
| Método enzimático | El segundo método es el de Sanger |
| Mètodo en el que Un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos una o ambas hebras con 32P(alta energía, señales dispersas), 33P o 35S (menor energía, bandas nítidas, mayor tiempo de exposición). | químico |
| Después, la muestra de ADN se divide en cuatro alícuotas y | se fragmenta en cuatro reacciones químicas distintas. |
| Separación por | electroforesis con base en su tamaño en cuatro carriles, cada uno representará los nucleótidos donde las muestras fueron cortadas |
| Las reacciones químicas que se utilizan para fragmentar la molécula de ADN son las siguientes: | corte de las purinas, corte de las adeninas, corte de pirimidinas, corte de citosinas. |
| Las purinas se metilan con dimetil sulfato (DMS).la reacción es en condiciones alcalinas. La molécula de ADN se fragmenta en las purinas metiladas. | Corte de las purinas |
| se obtiene una serie de bandas oscuras que corresponden a las guaninas (las cuales se metilan 5 veces más rápido), y bandas claras que corresponden a las adeninas. | Resultado del corte de las purinas |
| Las purinas metiladas se tratan inicialmente con un ácido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas metiladas. Después de un tratamiento alcalino las guaninas también son cortadas. | Corte de las adeninas |
| Que genera el tratamiento para adeninas | Este tratamiento genera una serie de bandas oscuras y claras que también corresponden a las adeninas, y las guaninas, respectivamente. |
| La presencia de NaCl 2M inhibe la reacción de hidracina con timina y el tratamiento posterior con piperidina produce solamente fragmentos que terminan en citosina. | Corte de citosina |
| Otro reactivo que se puede usar para el corte de citosinas | hidroxilamina |
| ¿En que se basa el metodo enzimatico? | en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminación específica. |
| Caracteristicas del metodo enzimatico | Uso de didesoxinucleotidos (análogos estructurales de los desoxinucleotidos que provocan la detención de la reacción de síntesis de DNA). La necesidad de un cebador. |
| Es el método más usado para la secuenciación de ácidos nucleicos. Esto se debe, en gran parte, a que se han realizado grandes avances en la automatización de esta técnica | Metodo enzimatico |
| En él metodo enzimatico no se degrada el DNA como en el método químico, si no que | se acude a la interrupción controlada de la síntesis de una hebra complementaria durante una replicación in vitro. |
| Estrategia del metodo enzimaticop | es hacer cuatro reacciones diferentes de síntesis de ADN, utilizando un didesoxinucleótido trifosfato (ddNTP) distinto en cada tubo. |
| ¿Que se puede generar con la mezcla del nucleótido normal (dNTP) y su terminador (ddNTP), | fragmentos complementarios de diferentes tamaños que terminan en el mismo nucleótido. |
| Después, estos fragmentos se pueden separar en | un gel de electroforesis con cuatro carriles distintos, para determinar la secuencia del templete. |
| ¿Que es lo que permite automatizar el metodo de secuenciacion? | La posibilidad de usar un fluorocromo distinto en cada una de las 4 reacciones de síntesis , de forma que se lean simultáneamente las hebras marcadas componentes de las 4 mezclas. |
| esta lectura de la fluorescencia se puede hacer en continuo, con lo que la electroforesis sigue transcurriendo. | Verdero |
| Las moléculas de menor tamaño, ya detectadas, se salen por el extremo inferior del gel, y se sigue consiguiendo la separación de moléculas mayores en el gel, de modo que | se amplía el numero de nucleótidos que se pueden secuenciar en un solo experimento. |
| Fluorocromos más usados | FAM, JOE, TAMRA, ROX |
| ¿Porque es mas dificil la secuenciacion de RNA que de DNA? | Por su menor estabilidad |
| ¿Como se obtiene la secuencia de RNA? | Es posible deducirla a partir de la secuencia del DNA que se transcribe, o también sintetizar un cDNA a partir del RNA de interés. |
| A veces es necesario secuenciar directamente el RNA. | Verdadero |
| los métodos de secuenciación de ARN se dividen en 2 categorías: | directo e indirecto |
| Métodos directos: | químico, enzimàtico |
| ¿En qué consiste el método directo químico? | Marcar el extremo 5’ terminal de la molécula de ARN mediante la acción de la enzima T4 polinucleótidoquinasa que incorpora un grupo radiactivo 5’[γ32P o γ35S]. |
| ¿En que se diferencia el metodo directo quimico del ARN al del DNA? | en las condiciones de reacción y los reactivos, los pasos de separaciòn y lectura son equivalentes |
| ¿En qué consiste el método directo enzimático? | No es equivalente al método de secuenciación de ADN, sino una variante del método de degradación química. |
| ¿Que utiliza el metodo directo enzimatico? | Utiliza la especificidad de corte de ribonucleasas para degradar una base o grupos de bases. |
| Menciona la función de las enzimas | La ribonucleasa T1, ARNasa T1, corta en guaninas, la ARNasa P corta en pirimidinas (C+U), la ARNasa U2 corta en adeninas y la ARNasa I corta en adeninas, guaninas y uracilos. |
| ¿En que consiste el metodo indirecto para la secuenciacion del ARN? | En este caso, el ARN se convierte primero a cADN con la enzima transcriptasa reversa y luego se usa el fragmento obtenido como templete para la reacción de secuenciación. |
| ¿Qué es lo que en realidad determina el metodo indirecto? | En realidad, este método determina la secuencia de una molécula de ADN, a partir de la cual se infiere la secuencia de la molécula de ARN. |
| ¿Porque el metodo indirecto es uno de los metodos mas comunes para la secuanciacion de ARN? | porque tiene todas las ventajas de la secuenciacion de ADN |
| Menciona los dos elementos básicos para que se lleve a cabo las técnicas de hibridación | hebra sencilla de ácido nucleico no marcada + sonda de secuencia conocida marcada |
| ¿Que es hibridación? | En realidad, este método determina la secuencia de una molécula de ADN, a partir de la cual se infiere la secuencia de la molécula de ARN. |
| Es un método sensible de detección de uno o más fragmentos específicos de ADN dentro de una mezcla de fragmentos de ADN compleja y aleatoria. | Southern blot |
| Etapas de southern blot | separacion electroforetica, desnaturalizacion, transferencia, hibridaciòn, detección |
| ¿Con que se corta y aisla el DNA? | Con una enzima de restricción? |
| Los fragmentos se ordenan por tamaño en un gel (_____)en un campo electrico. | agarosa, electroforesis |
| ¿Que significa desnaturalizar ADN? | Que el ADN se vuelve de cadena simple. |
| ¿Con que se desnaturaliza el ADN? | Alcali |
| Los fragmentos contenidos en el gel se transfieren (8-12 h) a una ______ o de nylon. El ______ asciende por capilaridad y arrastra al DNA (en las bandas), que pasa desde el gel hacia la nitrocelulosa, en la cual se fija por ______. | membrana de nitrocelulosa, tampón , adsorción |
| La sonda hibrida sólo con el fragmento complementario buscado y ___ con otros. | NO |
| Dado que la sonda está marcada, el resultado de la hibridación se revela de acuerdo al marcaje: | autorradigrafía del filtro, detección de fluorescencia, análisis de imagen…. |
| Utilidad de Sothern Blot | Es un método habitual de análisis del DNA extraído de muestras de sangre, esputo, tejidos y células. Determina defectos genéticos. |
| El procedimiento es idéntico al de Souther Blot, pero el ácido nucleico analizado es RNA. | Northern Blot |
| Etapas de northern blot | aislamiento del RNA total, electroforesis, transferencia, hibridaciòn, detección |
| Se tiene que aislar el RNA ya sea del núcleo o del citoplasma, es decir: | el RNA total. |
| ¿Porque no es necesaria la fragmentación del RNA por endonucleasas? | por su menor tamaño |
| ¿Para que Una vez obtenido el RNA se somete a electroforesis en gel de agarosa en condiciones desnaturalizantes ? | para que los RNA se separen de mayor a menor tamaño. |
| ¿Que es una sonda? | es una secuencia de ácido nucleico (cDNA o RNA) que reconocerá las secuencias complementarias de ácidos nucleicos. |
| APlicaciones de Northern Blot | Obtener información sobre el tamaño de RNAs y sobre el modelo de expresión de genes específicos. Son utilizados como sondas para hibridar muestras de RNA aisladas en diferentes tejidos y así conocer los tipos celulares en los que se expresa el gen. |
| es una técnica molecular reciente que permite localizar un determinado fragmento de la secuencia de los ácidos nucleicos | FISH |
| Nombre completo de FISH | FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION |
| ¿Que tipo de sondas usa FISH? | marcadas con un fluorocromo para verificar la presencia o ausencia de secuencias génicas específicas y detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas. |
| ¿Sobre que se puede aplicar FISH? | Se puede aplicar sobre núcleos interfásicos de extensiones celulares o cortes de tejido o directamente en cromosomas. |
| (In situ = en el mismo lugar de origen) Es un tipo especializado de hibridación en soporte sólido, en la que la sonda se aplica sobre muestras en su ubicación natural, generalmente aquellas preparadas para microscopia. | Hibridación in situ |
| Tipos de hibridación in situ: | Tisular, cromosómica |
| Describe la hibridación tisular | Se realiza sobre cortes de tejido, células intactas, núcleos aislados Es una modalidad de hibridación importante para detectar virus patógenos para diagnosticar células cancerosas o para estudiar cambios en la expresión génica |
| Describe la hibridación cromsómica | Se realiza sobre preparaciones en cromosomas metafásicos o prometafásicos, tratadas con fijadores para preservar las características morfológicas del cromosoma |
| Pasos para FISH | Preparación de la muestra de DNA Preparación de la sonda. Pretratamiento. Desnaturalización. Hibridación. Detección. |
| Que factores determinan el procedimiento para preparar la muestra | la naturaleza del mismo y los requerimientos específicos del experimento. |
| ¿Que se usa para la fijacion? | Lo comúnmente usado es 4% paraformaldheído, 4% formaldheído o 1% glutaraldheído, obteniendo una mayor tasa de entrecruzamiento. |
| ¿Como es llevada la fijación? | La fijación es llevada a cabo usualmente entre 0-4 °C inhibiendo de esta manera las endonucleasas endógenas. |
| Al preparar la muestra, se desenmascaran las secuencias de ADN o ARN de interés por lo que se facilita | el acceso de las sondas marcadas y de las moléculas de detección. |
| Tipos de sonda y método de síntesis | -Sondas de DNA doble cadena - Sondas de DNA de cadena simple - Oligonucleótidos |
| Sondas que proporcionan una alta sensibilidad en la detección de cadena sencilla. | sondas largas de cadena simple (RNA o DNA) |
| son muy sensibles y la señal puede ser incrementada por el uso de un cocktail de sondas. | oligonucleótidos |
| Las sondas largas pueden emitir una señal más fuerte debido a | que incorporan mayor número de nucleótidos marcados dentro de ella. |
| Las sondas que son tan largas dan señales débiles, debido a | que la sonda penetra menos eficientemente en el tejido |
| ¿Que se usa para el marcaje radio activo? | isótopos. 35S |
| son una alternativa de los marcajes radioactivos. | nucleótidos marcados con fluoresceína |
| pueden ser incorporados enzimáticamente a los ácidos nucleicos | La fluoresceína dUTP/UTP/ddUTP |
| Antes de la hibridación, el tejido debe tener un pretratamiento para que | incremente la eficiencia de la hibridación y minimice los pegados inespecíficos. |
| a) Los tejidos o secciones son usualmente tratadas con solventes orgánicos como: | etanol o metanol |
| b)Tratamiento con proteasas para facilitar la accesabilidad. Las proteasas más utilizadas son | proteinasa K, pepsina, tripsina, pronasa E y colagenasas. |
| ¿Cuales son los ultimos 4 pasos para el pretratamiento? | proteinasa K, pepsina, tripsina, pronasa E y colagenasas. |
| Desnaturalizaciones usadas tradicionalmente | alcalinas |
| ¿Porque ha llegado a ser popular la desnaturalización por calor? | , por su simplicidad experimental y por eficacia.Sube la temperatura a 80°C por dos minutos y después se enfría a 37°C |
| ¿Como se realiza la hibridación? | se realiza bajo condiciones óptimas que permiten la renaturalización de la sonda al ácido nucleico (blanco) en el tejido. |
| ¿Porque es lavado el tejido? | para remover las sondas que no se hibridaron. |
| ¿De que depende la hibridacion? | de la capacidad que el DNA desnaturalizado tenga para renaturalizarse con la cadena complementaria justo por debajo de su Tm (temperatura de fusión). |
| ¿Por medio de que microscopio se lleva a cabo la detección? | Microscopio de fluorescencia. |
| ¿Como funciona el microsocpio de fluoresencia? | Contiene una lámpara para excitar el fluorocromo y un filtro especial, el cual transmite un alto porcentaje de luz emitida por el fluorocromo |
| Utilidad de FISH | Diagnóstico de las neoplasias hematológicas, mapear genes, diagnóstico de anomalías cromosómicas , localización topográfica de una secuencia de ADN específica, en estudios para determinar la existencia de amplificaciones, traslocaciones o delecciones. |
| ¿Que es la retrotranscripción? | También denominada transcripción inversa. Es utilizada para poder realizar PCR a partir de RNA. Dado que las taq polimerasas son incapaces de usar RNA como molde, se utilizan retrotranscriptasas (virales) para obtener cDNA. |
| ¿Como se genera el DNA vírico? | por transcripción inversa (retrovirus o virus de cadena positiva). |
| El propio RNA vírico codifica los | productos proteínicos. |
| La transcriptasa inversa se encarga de | convertir el genoma en cDNA (cadena de DNA negativa). |
| ¿De que se trata RT-PCR? | de una amplificación de RNA a través de la sintesis previa de su cDNA que después se amplifica por PCR. |
| No se obtienen copias de RNA de partida, sino de | DNA |
| Es el método con mayor capacidad de detección de los disponibles para la medida de la expresión génica in vitro. | RT-PCR |
| ¿Para que se utiliza RT-PCR? | Se utiliza preferentemente para amplificar mRNAs de células asequibles. También se ha aplicado al análisis de transcritos de genes expresados en grado mínimo. |
| ¿Qué es la 1ª Transcripción Reversa? | Síntesis de la primera cadena del cDNA mediante la acción de la transcriptasa inversa. |
| ¿Que elementos intervienen en la transcripcion reversa? | RNA molde Cebadores de DNA Transcriptasa inversa RNAasa H Desoxinucleotidos fosfato Buffer |
| ¿Que ocurre en la segunda etapa? | Se desnaturaliza el dúplex y comienza la amplificación según el mecanismo de una PCR normal: la hebra de cDNA liberada actúa como molde para una segunda hebra de cDNA y luego el dúplex se amplifica en sucesivos ciclos. |
| Teóricamente, basta una molécula de RNA que esté intacta entre los dos sitios de unión al cebador para conseguir | la amplificación. |
| Bajo el mismo principio, también se puede amplificar RNA usando | la polimerasa Tth (Thermus thermophilus), que contiene el mismo tiempo de actividades DNA polimerasa y trasncriptasa inversa. |
| Aplicaciones de RT-PCR | Cuantificación de la expresión génica Bibliotecas de cDNA Diagnostico de enfermedades: VIH,Hepatitis C Celulas tumorales |
| Es un método que permite la cuantificación de ácidos nucleicos con gran exactitud y afinidad. Basada en la monitorización de la PCR usando técnicas de fluorescencia. En esta técnica se emplean sondas marcadas con fluorocromos. | qPCR en Tiempo Real |
| ¿Que son las sondas de hidrolisis? | son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento de ADN que se quiere amplificar. Uno de los fluorocromos actúa como donador de fluorescencia en el extremo 3´. |
| La ADN polimerasa se desplaza sobre la cadena de ADN sintetizando la cadena complementaria a partir de | un fragmento de ADN que sirve como molde (cebador) |
| Al llegar al punto donde la sonda se ha hibridado, la _____. El fluorocromo del extremo 5´ de la sonda es ___. | hidroliza, liberado |
| El fluorocromo aceptor no puede entonces absorber la fluorescencia del donador por | estar alejado de él espacialmente. |
| Un detector realiza la medida de esta fluorescencia, que es proporcional a | ala cantidad de ADN presente y la representa gráficamente. |
| Ventacjas qPCR- tiempo real | La principal ventaja de este método es su mayor sensibilidad lo que disminuye el riesgo de falsos negativos. Es más rápida y tienen menos probabilidad de contaminación con lo que disminuyen los falsos positivos. |
| APlicaciones de qPCR-tiempo real | Cuantificación viral Cuantificación de expresión génica Control de eficacia de fármacos Detección de patógenos Diagnóstico de tumores Discriminación alélica (polimorfismos |
| ¿Que son los microarreglos? | Es un arreglo de cientos de millares de secuencias de ADN inmovilizadas y bien ordenadas en forma de matriz adheridas a una superficie sólida, generalmente de cristal. Cada secuencia corresponde a un gen diferente. |
| Tipos de microarreglos en el DNA | 1) Los microarreglos de DNA complementarios (cDNA) o Microarreglos Punteados 2) Los microarreglos de oligonucleótidos de alta densidad |
| ¿para que es utilzada esta tecnica? | utilizada para detectar niveles de expresión de los genes colocados en el microarreglo |
| ¿Como se logra? | extrayendo el mARN de la célula de interés, sometiéndolo a transcripción inversa para generar una sonda, que es hibridizada sobre la matriz, de manera que para cada gen se detecta el grado de fluorescencia, lo cual da el nivel de expresión del gen. |
| En que consisten los microarreglos punteados | Usan generalmente muestras de ADN de 500 a 5000 bases producidos por PCR a partir de bibliotecas o de bases de datos como Gen- Bank, UniGene, dbEST, etc. Las secuencias son depositadas sobre la superficie sólida por un robot en lugares definidos. |
| Metodos para depositar puntos | Distribuidor activo Distribuidor pasivo |
| ¿En que consiste la superficie sòlida? | generalmente es un portaobjetos especialmente cubierto pero también se pueden usar membranas de nylon y portaobjetos cubiertos de oro. |
| Tamaño de los puntos de la matriz | varía de 80 a 150 μm de diámetro y en un solo portaobjetos cabe un máximo de 80,000 puntos. |
| ¿Que es comun en los microarreglos punteados? | comparar las expresiones genéticas de dos muestras biológicas (tejido con tumor vs. tejido sin tumor, por ejemplo) en un mismo portaobjetos, así que el mRNA es preparado para que los dos niveles de expresión puedan ser medidos |
| Son construidos comercialmente y tienen una precisión y densidad muy alta al usar oligonucleótidos cortos de 20 a 25 bases. | Los microarreglos de oligonucleótidos de alta densidad |
| Los high density oligonucleotide microarrays son mas caros que los spotted microarrays. Debido a | su gran precisión se puede usar este tipo de microarrays para comparar diferentes expresiones de genes generados por diferentes microarreglos. |
| Spotted microarrays permiten la medición simultanea de dos muestras de RNA en el mismo microarray, en el high density oligonucleótido | no se puede hacer esto |
| Problemas con datos de microarreglos: | Los niveles de expresión tiene un alto nivel de variabilidad de experimento a experimento. Hay un pequeño número de muestras comparado con el número grande de variables. |
| ¿Como se arregla el problema de la variablidad? | se usan técnicas de normalización, de pre-procesamiento y de filtrado. |
| ¿como se arregla el problema del pequeño numero de muestras? | se usa técnicas de reducción de dimensionalidad |
| Objetivo básico de la PCR | Amplificar DNA |
| ¿Para que amplificar ADN? | Para disponer de cantidad suficiente para utilizarlo, con fines diversos |
| Otro de los objetivos de la PCR es para detección para | detectar en muestras con pequeñas cantidades de muestra de DNA. |
| APlciaciones de la PCR | Clonación acelular de fragmentos de DNA. Detección de secuencias. Polimorfismo. Mutaciones. Tipado de DNA para trasplantes. Enfermedades genéticas. Problemas forenses o arqueológicos |
| Pasos del metodo: | desnaturalizaciòn, hibridación, replicacion |
| ¿En que consiste la desnaturalizaciòn? | Del DNA para dar hebras sencillas. |
| ¿En que consiste la hibridaciòn? | Especifica de la hebra sencilla con un oligonucleótido. Esta es la etapa que explica por qué se debe conocer parte de la secuencia. |
| ¿Porque se le denomina etapa templado? | entendido como disminución de temperatura que permite la reasociación de hebras sencillas tras la desnaturalización térmica; en ingles annealing) |
| ¿En que consiste la replicación? | De la hebra sencilla por un DNA polimerasa a partir del oligonucleótido anterior como cebador, también, elongación, o extensión del cebador, o polimerización. |
| Para la realización práctica se precisan en la mezcla de reacción los siguientes reactivos: | Templete de DNA, dNTPs , Oligonucleótidos, DNA polimerasa, Buffer,Mg2+: |
| Actúa como punto de e inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra madre. | templete de DNA |
| Actúan como sustratos para la síntesis de las copias de DNA. | dNTPs |
| Pueden ejercer cebadores para la replicación de dos hebras en la región diana. | oligonucleotidos |
| Permite su actuación en sucesivos codos sin activarse; además, la replicación a temperaturas elevadas impide la formación de híbridos parcialmente desapareados y contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso. | DNA polimerasa |
| Estabiliza el medio de reacción a un determinado pH para el buen funcionamiento de la enzima. | buffer |
| Cofactor. | Mg2+ |
| ETapas de PCR | Se requiere una sucesión de ciclos (entre 20 y 40, de 1.5 a 5 minutos de duración cada uno) de desnaturalización, hibridación y replicación, para conseguir una enorme amplificación del número de moléculas que contienen la secuencia de interés o diana. |
| ¿Duración total de la PCR? | 2 horas |
| Calentamiento para la separación de las dos hebras del DNA mediante una incubación breve (30-120 s) a una temperatura entre 94-95 C (en humanos), que debe ser superior a la de fusión de la región de DNA que se quiere amplificar. | Desnaturalización: |
| Enfriamiento rápido por debajo de Tm, de forma que se repite la hibridación de las hebras sencillas del DNA de interés con los oligos cebadores. Generalmente se usan temperaturas de 50-60 C que se mantienen entre 10 y 120 s. | Templado (o hibridación |
| Etapa de amplificación propiamente dicha (72-75 C, 1-3 min), en la que la DNA polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. | Elongación (o replicación): |
| La replicación transcurre en dirección 5’→3’ a partir del extremo 3’-OH de cada cebador, empleando como sustrato los cuatro dNTPs, hasta terminar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva etapa de : | desnaturalizacón |
| Además de las 3 etapas de cada ciclo comúnmente se añade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. | Verdadero |
| Etapa previa: | elevada temperatura, sirve básicamente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra, así como para asegurar la desnaturalización completa del DNA de partida, especialmente si éste es de gran tamaño o posee regiones muy compactas. |
| Etapa final | consiste en una prolongación de la última elongación, para permitir que se completen todos los fragmentos. |
| Puesto que los productos de cada ciclo sirven de molde para la siguiente, la acumulación de copias es exponencial en vez de lineal. Sin embrago, en la práctica el rendimiento de cada etapa no es completo, por lo que las cifras se ven algo reducidas. | rendimiento |
| de cada una de las tres etapas de cada ciclo y el número de ciclos deben optimizarse, dependiendo de la secuencia concreta que se quiera amplifica. | duración |
| muy elevada. determinada por la secuencia de los cebadores utilizados y por las condiciones de templado. Se puede determinar analizando por electroforesis los productos generados: la aparición de una banda única indica que la técnica es específica. | especificidad |
| Es muy alta (bajo límite de detección), tanto que la PCR puede permitir detectar una única molécula de DNA en casi cualquier tipo de muestra clínica, forense o arqueológica. | capacidad de detección |
| Es decir la capacidad de copiar secuencias con precisión, sin introducir mutaciones. Esta característica depende sobre todo de que la enzima empleada tenga o no actividad correctora de pruebas. | fidelidad |
| ¿cual es el proposito de las variantes de PCR? | mejorar el rendimiento o la especificidad, adaptarse a muestras particulares, amplificar moléculas de RNA en lugar de DNA, producir cadenas de hebra sencilla. |
| PCR “larga | Denominada L-PCR (Long PCR) o LA-PCR (Longer and Accurate PCR,”PCR más larga y exacta”), su objetivo es superar los límites de la PCR convencional para amplificar con fidelidad regiones diana de gran tamaño (entre 5 y 40 kb). |
| El principal factor limitante es la ausencia de actividad correcta de pruebas en la | polimerasa Taq. |
| La especificidad puede aumentarse realizando una segunda reacción de PCR, con dos cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer par, dando así lugar a productos de PCR más cortos, pero más específicos. | PCR “anidada” |
| Las copias correctas de la primera diana contendrán ambas secuencias complementarias a los nuevos cebadores, a diferencia de los productos no específicos generados en la primera PCR, que por ello no resultarán amplificados en la segunda. | Las copias correctas de la primera diana contendrán ambas secuencias complementarias a los nuevos cebadores, a diferencia de los productos no específicos generados en la primera PCR, que por ello no resultarán amplificados en la segunda. |
| se emplea para clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posición vecinal a secuencias diana conocidas. se amplifica la región externa, que flaquea a los cebadores. | PCR inversa |
| Por ello es necesario contar el DNA a ambos lados de la región diana con una enzima de restricción, de tal forma que los extremos cohesivos resultantes puedan | hibridar entre sí, formando una molécula circular. Ésta es cerrada por una ligasa y se realiza la PCR con cebadores que hibridan con los extremos 5’ de la secuencia conocida, por lo que la elongación se extenderá alrededor del círculo. |
| También puede amplificarse una región de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de restricción unos adaptadores, oligonucleótidos sintéticos con extremos cohesivos compatibles con los generados en la muestra. | PCR con adaptadores |
| Una vez desnaturalizados, se añaden cebadores específicos para las secuencias 3’ de los adaptadores. Se amplifica así | el conjunto de adaptadores y secuencia diana. |
| se trata de generar copias de hebra sencilla de un DNA. En la variante más simple, se añaden cantidades muy diferentes de ambos cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de PCR uno de ellos se agota y, sólo una de sus hebras sigue amplificándose. | PCR asimétrica |
| también llamado “inmunoblotting” debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antígeno o los antígenos específicos de interés | western blot |
| El término “blotting” hace referencia a | la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma. |
| La especificidad de la unión antígeno –anticuerpo permite | la detección de una única proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas |
| es una sustancia que puede causar una respuesta inmunitaria, son usualmente proteínas o polisacáridos. | antigeno |
| proteínas producidas por el sistema inmunológico para identificar y neutralizar las sustancias dañinas y extrañas al cuerpo (antígenos). son sintetizados por los linfocitos B. | anticuerpos |
| ¿Que requiere el westerm blot? | Anticuerpo monoclonal o policlonal Solución que contenga la proteína |
| Métodos western blot | directo e indirecto |
| Tipos de marcaje western blot | Biotina Fluoresceína Rodamina Peroxidasa de rábano (HRP) Fosfatasa alcalina. |
| Es una técnica ampliamente utilizada para separar proteínas de acuerdo a la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores. | SDS-PAGE |
| un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas, eliminando sus estructuras secundaria y terciaria, pero sin alterar los enlaces disulfuro y además confiere una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa. | SDS |
| La técnica de SDS-PAGE posee un alto poder de resolución gracias a | un sistema que utiliza dos geles de poliacrilamida diferentes en un solo montaje. Gel de apilamiento, gel de resolución |
| Pasos de SDS-Page | Electroforesis Transferencia de las proteínas a la membrana. Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos. Lavado de la membrana. Adición de Anticuerpos Adición del sustrato Captura de los datos |
| Después de la separación electroforética de las proteínas por su peso molecular, éstas deben transferirse desde el gel de electroforesis a | la membrana |
| Metodos para la transferencia | la difusión, la capilaridad, por vacío o por electroelución |
| Implica poner en contacto directo el gel de poliacrilamida con las proteínas con la membrana de nitrocelulosa, formando un sándwich entre dos electrodos sumergidos en una solución conductora | Transferencia de las proteínas a la membrana. |
| Cuando se aplica un campo eléctrico, las proteínas migran fuera del gel de poliacrilamida hacia la superficie de la membrana donde quedan fuertemente adheridas, por lo que la membrana resultante es una | copia exacta del patrón de proteínas que se tenia en el gel de poliacrilamida. |
| Es muy importante en un Western Blot bloquear los sitios de unión de la membrana sin reaccionar con el antígeno, para | reducir la unión inespecífica de las proteínas durante los siguientes pasos del ensayo. |
| Estos tampones de bloqueo, lo que hacen es | incrementar la sensibilidad del ensayo reduciendo la interferencia por el ruido de fondo (background). |
| los lavados son necesarios para | eliminar los excesos de reactivos no unidos y para reducir el ruido de fondo, ayudando a incrementar la relación señal:ruido. |
| Un lavado insuficiente de la membrana ocasionara un | elevado ruido de fondo, mientras que un exceso del mismo puede ocasionar una disminución de la sensibilidad |
| Tampones fisiológicos como el ¡ | TBS o PBS |
| La elección del anticuerpo primario para dependerá del | antígeno que se desee detectar y de los anticuerpos disponibles para ese antígeno en concreto. |
| son muy valorados por su gran especificidad, pureza y consistencia que originan un menor ruido de fondo. | monoclonales |
| son bastante más baratos, se tardan menos en producir y normalmente tienen una elevada afinidad por su antígeno | policlonales |
| El marcaje con enzimas se utiliza más ampliamente y, aunque necesita algunos pasos extra, suelen ser | bastante sensibles |
| Las dos enzimas que más se utilizan son | la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa de rábano (HRP) |
| la adicion del sustrato dependerá de | la enzima utilizada (AP o HRP), la sensibilidad deseada y el método de detección o tipo de señal que se busque (colorimetría, fluorescencia, quimioluminiscencia, etc.). |
| Para HRP los sustratos más utilizados son | TMB y DAB |
| se define como la emisión de energía en forma de luz a partir de una sustancia, como consecuencia de una reacción química.Utiliza luminol | proceso de la quimioluminiscencia |
| la captura de los datos se lleva a cabo en | Películas de autoradiografía Cámaras CCD refrigeradas, |
| método que se usa para la visualización de moléculas de pequeño peso molecular. Detecta polisacáridos . usada para detectar modificaciones post-traduccionales de las proteínas como: lípidos, carbohidratos y otra modificación de las proteínas. | eastern blot |
| etapas de eastern blot | TLC (Cromatografia de capa fina) Separación Transferencia Incubación Detección con anticuerpos. Cuantificación. |
| ¿que es electroforesis? | Es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica. |
| ¿En que se basa la electrofeoresis? | Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. |
| Medios de soporte de electroforesis: | Baja fricción: papel, acetato de celulosa (separaciòn por carga) Elevada fricción: gel de almidón, poliacrilamida,agarosa (separación por forma, tamaño y carga) |
| se emplea principalmente en la separación de sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos. | electroforesis en papel |
| Un material muy fiable como filtro membrana por su excelente estabilidad química frente a soluciones acuosas con pH entre 4 y 8, la mayoría de los alcoholes, hidrocarburos y aceites. | acetato de celulosa |
| CONCENTRACION UTILIZADA: .3 A 2% | gel de agarosa |
| EXISTEN UNA SERIE DE FACTORES QUE AFECTAN O MODIFICAN LA TASA DE MIGRACIÓN DEL ADN EN GELES DE AGAROSA: | Tamaño del ADN, Concentración de Agarosa, Conformación del ADNVoltaje aplicado, Dirección del campo eléctrico,Composición de bases y temperatura Presencia de colorantes intercalares Composición del Buffer de corrida |
| es un monómero que en presencia de radicales libres forma con la bis-acrilamida cadenas que se entrecruzan y crean un polímero de porosidad variable. Dicha porosidad es determinada por la longitud de las cadenas y el grado de entrecruzamiento molecular. | poliacrilamida |
| Tipos de geles de poliacrilamida | desnaturalizantes, no desnaturalizantes |
| gel de poliacrilamida para la separación y purificación de fragmentos de ADN doble cadena. | no desnaturalizante |
| gel de poliacrilamida para la separación y purificación de fragmentos de ADN simple cadena. | desnaturalizante |
| Soluciones buffer utilizadas | Triacetato, trifosfato, triborato |
| SOLUCIÓN BUFFER DE CARGA tienen tres propósitos: | a)Incrementan la densidad de la muestra, b) Aseguran que el ADN caiga directamente dentro de la muesca del gel, c) Otorgan color a la muestra |
| Se utiliza papel para aminoácidos u otras moléculas pequeñas y acetato de celulosa para proteínas | medio de soporte horizontal |
| Se utiliza gel de poliacrilamida para proteínas y ácidos nucleicos de pequeño tamaño | vertical |
| En cuanto a composición del gel hay 2 variantes: | continua (1 gel) discontinua ( 2 tipos de gel de composición ligeramente diferente) |
| Que se emplea para la Tinción de proteínas y de ácidos nucleicos | Se emplean sustancias coloreadas o fluorescentes que se unen a las proteínas o ácidos nucleicos. |
| Sustancias para teñir porteinas_ | azul brillante de coomassie, negro amida, rojo ponceau, nitrato de plata |
| Para los ácidos nucleicos se usa el | azul de metileno y compuestos fluorescentes e intercalantes como el bromuro de etidio. |
| Tras la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo; el gel se sumerge en un recipiente con una disolución del colorante y se espera a que se impregne y así se una a las moléculas separadas en el gel. | Tras la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo; el gel se sumerge en un recipiente con una disolución del colorante y se espera a que se impregne y así se una a las moléculas separadas en el gel. |
| Tras lavar el gel para eliminar el exceso de tinción no unida específicamente, se | observa, fotografía o cuantifica por densitometría. |
| Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden ____ mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. | revelar |
| Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente | bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. |
| La visualización de las bandas puede hacerse directamente por tinción con los colorantes, a través de | autoradiografía utilizando “iniciadores” marcados con radioisótopos en la reacción de PCR o mediante fluorescencia. |
| es el método analítico con mayor sensibilidad, | deteccion por fluoresencia |
| la detección radioactiva y mediante tinción con AgNO3 | tienen sensibilidad equivalente. |
| Aplicaicones de electroforesis en acidos nucleicos | En los fragmentos de ADN dobles la velocidad de migración es inversamente proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN y ARN, dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma más complicada. |
| Aplicaicones de electroforesis en proteinas | sus velocidades de migración no son similares entre ellas. puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz.Las proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente como el dodecilsulfato sódico/dodecilfosfato sódico (SDS/SDP). |
| Aplicaciones | determinación de la masa molecular, del punto isolelectrico, isoenzimas,mapas de restricción y secuenciación |
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