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Biochimie
Biochimie métabolique L3 SDV BCM
| Question | Answer |
|---|---|
| Méthode analytique : Que permet-elle? | Permet d’analyser certaines propriétés des protéines, mais ne permet pas d’en avoir des quantités suffisantes à la fin. |
| Méthode analytique : Qu'est ce qu'une protéine? | Elle est responsable de toutes les activités dans la cellule, c’est un produit d’expression des gènes. |
| Méthode analytique : Qu'est ce que l'interaction stéréospécifique? | C'est l'interaction d’une ou des protéines avec d’autres molécules. |
| Méthode analytique : Qu'est ce que l'interectomie? | Protéines qui interagissent entre elles. Elles n’agissent pas toutes seules, elles nécessitent l’interaction avec une autre protéine, soit la même soit une autre. |
| Electrophorèse : Qu'est ce? | C'est le déplacement d’une particule dans un champs électrique. Si charge électrique augmente, les petits protéines migrent plus vite et plus viscosités grandes plus la mobilité (= propriété intrinsèque) diminue. |
| Electrophorèse : Quels sont les différentes forces ou mobilité retrouvé? | On y retrouve la force électrique (Fe=qE), la force de friction (Ff=6πηrv) et la mobilité électrophorétique (µ=v/τ=q/6πηr) |
| Electrophorèse : Quels sont les différents supports? | Acétate de cellulose, Agarose, Gel de polyacrylamide. |
| Electrophorèse : Qu'est ce qu'un gel agarose? | Gel horizontale Polysaccharide (polymère de sucre), hautement hydrophile, séparation des acides nucléiques selon la taille, ADN du côté cathode migre vers l’anode, utilisation colorant = bromure d’éthidium un agent intercalent. |
| Electrophorèse : Qu'est ce qu'un gel de polyacrylamide? | Création de longues fibres de 20 à 30 monomères, pour solidifier le gel utilisation du N,N’-méthylène-bis-acrylamide = agent de portage. |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Qu'est ce? | Système vertical Discontinue = 2 gels -> Gel de résolution (=running gel) et Gel de concentration (=stacking gel). 2 tampons (=running buffer) dans lesquelles cathode (haut) et anode (bas). Protéines séparer selon la taille. |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Quel est la charge de l'ADN et de la protéine? Comment varie le point isoélectrique comparé au pH? | ADN toujours chargé(-) mais protéine varie car arginine et lysine charge(+), glutamate et aspartate charge(-). Charge = point isoélectrique (pI) dépend pH : pH > pI = charge(-), pH < pI charge(+), pH = pI pas charge(0). |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Que se passe-t-il avec un ajout de molécule SDS? | Molécule SDS = détergent ionique. 1,4mg de SDS/mg de protéines. Provoque la dénaturation de la protéine et apporte des charges(-). Si ponts disulfures, on ajoute le β-mercaptoéthanol (BME). |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Que se passe-t-il avec un ajout de glycérol? | Glycérol = petite molécule soluble, visqueux et dense. Augmente la densité de l’échantillon. |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Que se passe-t-il avec un ajout de bleu de bromophénol? | Bleu de bromophénol = colorant bleu, appelé tracking dye, chargé(-). Permet de voir le fond de migration. |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Que se passe-t-il avec un ajout de Tris? | Tris = tampon. Il maintient le pH, généralement pH = 6,8. |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Comment se passe la migration du tampon de migration (TM) au gel de résolution (GR)? | TM (pH=8,3) Gly, Cl- migre vite -> zone échantillon (ZE). ZE (pH=6,3) Gly freine. Crée zone faible conductivité électrique et forte résistance. Stacking gel (pH=6,7)(5%Acry) front migration entraine prot. GR (pH=8,8)(10%Acry) prot freine Gly, Cl- devant |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Quels sont les différents colorants? | Bleu de Coomassie : facile, bon marché, peu sensible Nitrate d’argent : très sensible, long à use et couleurs ≠ concentrations Fluorochrome : très sensible, facile à use, quantifications, cher |
| Electrophorèse, SDS-PAGE : Comment estime-t-on le poids moléculaire? | Tracer la droite log(poids moléculaire)=f(Rf), avec Rf le marqueur de taille. On mesure le Rf de la protéine inconnue et qu’on reporte sur la droite. On obtient le poids dénaturé, peu précis. Rf=(distance_protéine)/(distance_front) et Rf < 1 |
| Electrophorèse, Focalisation isoélectrique (IEF) : Qu'est-ce? | Sépare les protéines en fonction de la charge intrinsèque, pas d’ajout SDS. Ajout d’urée = agent dénaturant = agent chaotropique qui n’apporte pas de charge. Migration dans gel acrylamide. |
| Electrophorèse, Focalisation isoélectrique (IEF) : Que se passe-t-il avec un ajout d'ampholytes? | Ampholytes = fonction acide/basique, forme gradient de pH. Les protéines placés sur la totalité du gel. Anode = acide, cathode = basique. Les protéines migrent en fonction de leur charge jusqu’au pI. |
| Electrophorèse, Focalisation isoélectrique (IEF) : Quand l'utilise-t-on et que permet-il d'observer? | Utilisation IEF surtout pour les électrophorèses bidimensionnelles. Focalisation isoélectrique (≠ pI) puis SDS-page (gel polyacrylamide)(≠ poids moléculaire). Permet voir ensemble de protéines synthétisé par un organisme = protéome. |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est ce? Quels sont les calculs de la longueur d'onde et de l'énergie que porte un photon? | Interaction d’un rayonnement électromagnétique avec la matière, donne information sur la matière, généralement structurel. Longueur d’onde : λ=c/µ Energie que porte un photon : E = hµ Avec µ la fréquence, c vitesse lumière |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est que la spectroscopie d'absorption? Quel calcul utilise-t-on pour la quantification de l'absorption? | Absorption de la lumière par des molécules. Exemple : chlorophylle Quantification de l’absorption = Loi de Beer-Lambert : A = Ԑcl Avec Ԑ, coefficient d’extinction molaire, en M-1.cm-1 ; c en M et l=1cm |
| Méthodes spectroscopique : Quels sont les autres formules utilisé pour la spectrométrie d'absorption? | Intensité : I=I0×10^(-εcl) Absorbance : A=log(I0/I) Transmittance : T=I/I0 |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est ce que le point isobestique? | Point où deux molécules ont le même Ԑ qui dépend de la λ. Sert de point de référence. |
| Méthodes spectroscopique : Quels sont les différents types de spectrophotomètres? | Monofaisceau : 1 seul faisceau ac 1 cuvette, réf = 0. Double faisceau : 2 cuvettes = échantillon + réf. Barette de diodes : ds instrumt de chromato où mesure abs en ligne. Effluents sort colonne. Eclaire ac lumière blanche. Obtient spectre lumière. |
| Méthodes spectroscopique : Quel est la particularité des acides aminés aromatiques par rapport aux protéines? | Acides aminés aromatiques ont spectre d’absorption UV : Tryptophane (Trp) > Tyrosine (tyr) > Phénylalanine (Phe). Si une protéine n’a pas de Trp, elle absorbera peu ou pas. Absorption caractéristiques des protéines : 280nm |
| Méthodes spectroscopique : Que permet l'absorption? | L'absorption permet la quantification dans les extraits bruts |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est ce que la chromatographie? | Permet la séparation de protéines. Le système enregistre l’absorbance en fonction du temps ou du volume ce qui permet de suivre l’élution des protéines de la colonne. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les dosages de protéines les plus utilisé, on retrouve la méthode de Biuret. Qu'est ce? | C'est la réduction des atomes de cuivre (Cu2+/Cu+). Cu+ donne coloration bleu. Peu sensible |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les dosages de protéines les plus utilisé, on retrouve la méthode de Lowry. Qu'est ce? | C'est la réduction des atomes de cuivre (Cu2+/Cu+). Coloration jaune qui vire bleue, λ=750. Utilisé (sensible). Ne peut pas être utilisé avec un réducteur dans la solution. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les dosages de protéines les plus utilisé, on retrouve le réactif de Bradford. Qu'est ce? | L'arg, tyr, trp réagissent avec le bleu de Coomassie. Donne coloration plus ou moins intenses en fonction des acides aminés. Sensible, λ=595nm. Faut pas de détergeant |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les dosages de protéines les plus utilisé, on retrouve le dosage à l'acide bicinchronique. Qu'est ce? | Sensible. Cu2+ -> Cu+. Coloration violette |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est ce que la spectroscopie de fluorescence? | Molécule passe de l’état excité à relâché (10^(-15)s). Libère de l’énergie pour repasser au niveau inférieur. 10^(-9)s = fluorescence, 10^(-3)s = phosphorescence |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est ce que le quenching? | C'est la transmission de l’énergie à une autre molécule |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les différentes caractéristiques des photons absorbés et émis, on retrouve le Stokes shift. Qu'est ce? | La longueur d’onde du photon absorbée toujours plus faible que celle émise. λex < λem |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les différentes caractéristiques des photons absorbés et émis, on retrouve le coefficient d'extinction molaire Ԑ. Qu'est ce? | Plus il est élevé plus une molécule va fluorescer de manière intense. Reflète la probabilité que les photons envoyés sur les molécules sont absorbés par celles-ci. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les différentes caractéristiques des photons absorbés et émis, on retrouve le Quantum yield (φ). Qu'est ce? | Aussi appelé rendement quantique. C'est la probabilité que la molécule relargue son énergie sous forme de fluorescence. Si φ = 0 uniquement absorbance et si φ = 1 uniquement fluorescence. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les différentes caractéristiques des photons absorbés et émis, on retrouve la photo stabilité. Qu'est ce? | Fluorochrome instable qui peut être détruit pas la lumière (= photo bleaching/fading). Fluorochromes peuvent subir qu’un certaine nombre de cycle excitation/relaxation avant d’être détruit. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les différentes caractéristiques des photons absorbés et émis, on retrouve l'intensité. Qu'est ce? | L’intensité de la fluorescence émis et la longueur d’émission dépend de l’environnement. Des facteurs jouent sur l’intensité de la fluorescence émis et la longueur d’onde émis, ce sont la polarité du solvant, le pH du milieu, et la présence de quenchers. |
| Méthodes spectroscopique : Comment varie le colorant, Rouge du Nil, varie au cours du temps? | Fluorescence verte dans milieu apolaire. Fluorescence jaune dans milieu polaire. |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est ce qu'un fluorochrome? | Molécules organiques, assez grosses, représenté forme cycles aromatiques conjugué qui donnent propriétés de fluorescences. |
| Méthodes spectroscopique : Quels sont les deux sortes de fluorescence pour la protéine? | Intrinsèque : due à la protéine. Extrinsèque : due molécule/fluorochrome ajouté à la protéine. |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est ce qu'un quencher? | Permet de suivre le repliement des protéines. Il diminue la fluorescence quand il a accès au trp. Donc si protéine est repliée : pas d’accès au Trp. Si changement de conformation, inhibition de la fluorescence. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les applications avec ajout de molécules fluorescentes qui vont interagir avec les protéines , on retrouve la Sonde ANS. Qu'est ce? | Longueur d'onde d’excitation = 394nm et d’émission = 495nm. Si fluorescence de la sonde alors fixation sur les surfaces hydrophobes qui sont exposées lorsque la protéine est partiellement repliée. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les applications avec ajout de molécules fluorescentes qui vont interagir avec les protéines , on retrouve les analogues de substrats. Qu'est ce? | Molécule qui ressemble au substrat d’une enzyme, peuvent subir la transformation de la réaction catalytique et les produits vont être fluorescents. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les applications avec ajout de molécules fluorescentes qui vont interagir avec les protéines , on retrouve les réactifs de marquage. Qu'est ce? | C'est un ajout de fluorochrome pour rendre les molécules fluorescentes. |
| Méthodes spectroscopique : Parmi les applications avec ajout de molécules fluorescentes qui vont interagir avec les protéines , on retrouve les colorants fluorescents. Qu'est ce? | Ils se fixent spécifiquement à toutes les protéines pour les rendre fluorescentes. |
| Méthodes spectroscopique, la GFP : Qu'est ce? | Protéine avec fluorescence naturelle, émettant dans le visible. Couleur naturelle verte. Si on change les acides aminés autour du fluorochrome, on change la couleur (longueur d’émission), appelé alors CFP ou RFP |
| Méthodes spectroscopique, la GFP : Qu'est ce qu'un système rapporteur? | Permet d’étudier l’activité d’un promoteur in vivo. On met le gène de la GFP juste après un gène codé par un promoteur. Si fluorescence = promoteur actif |
| Méthodes spectroscopique, la GFP : Qu'est ce qu'une protéine de fusion? | C'est la fusion de la GFP avec une autre protéine entière. Cela permet d’avoir la localisation subcellulaire. |
| Méthodes spectroscopique, la GFP : Pour quoi est-elle utilisé? | Pour détecter l’expression de protéines et sa localisation cellulaire. |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est que la diffusion transcriptionnelle? | C'est une méthode haut débit, si constructions dans microplaques de filtration. Permet de voir le promoteur exprimé, à partir d’échantillons, dans certaines conditions. |
| Méthodes spectroscopique : Qu'est ce que la microscopie à fluorescence? | Source lumineuse à l’arrière. Faisceau d’excitation excite molécule fluorescente de l’échantillon. Fluorochromes réémettent longueur d’émission. Miroir sélectionne longueur d’onde et renvoie à l’objectif. |
| Méthode immunologique : Qu'est ce qu'un antigène? | Molécule ou macromolécule naturelle ou synthétique, reconnue et déclenche une réaction immunitaire. Les fragments d’antigènes sont les haptènes. |
| Méthode immunologique, anticorps : Qu'est ce? | Glycoprotéines synthétisé par certaines cellules du système immunitaire des vertébrés. Particularité de reconnaitre d’autres molécules (= antigène) avec une très forte affinité. En forme de Y. |
| Méthode immunologique, anticorps : Quel est la structure des immunoglobulines? | Tétramères = 2 chaines légères + 2 chaines lourdes + reliée par des ponts disulfures de cystéines. Un pont pour relier une chaine légère/lourde ; deux ponts pour deux chaines lourdes. |
| Méthode immunologique, anticorps : Combien retrouve-t-on de domaine Fc et Fab sur les immunoglobuline et comment sont-ils constituées? | 1 domaine Fc : constitué de deux chaines lourdes, domaine constant de l’immunoglobuline, ne varie pas 2 domaines Fab : constitué d’une chaines lourde et légère, domaine variable, pas la même séquence |
| Méthode immunologique, anticorps : Quelles sont les différences entre les immunoglobulines au niveau des chaines lourdes et légères? | Type d’Ig différents en fonction de la chaine lourde. Les chaines légères sont κ ou λ. |
| Méthode immunologique : Les chaines légères et lourdes possèdent des régions distinctes, lesquelles sont-elles? | Chaine légère (220aa) et chaine lourde (440aa) Distinction région constante et région variable avec CDR = région hypervariables |
| Méthode immunologique : A quoi est due la variabilité des immunoglobulines? | Variabilité due à des mutations dans les gènes qui codent pour ces protéines et aux recombinaisons des gènes. La partie variable est complémentaire à l’antigène. |
| Méthode immunologique : Qu'est ce qu'un épitope et un paratope? | Epitope : partie de l’antigène reconnu par l’anticorps. Paratope : partie variable de l’immunoglobuline qui reconnait l’épitope Interaction entre épitope et paratope sont des liaisons faibles mais d’une très forte affinité. |
| Méthode immunologique : Qu'est ce anticorps polyclonal et monoclonal? | Anticorps polyclonal reconnait plusieurs épitopes. Anticorps monoclonal reconnait un seul épitope. |
| Méthode immunologique : Comment calcul-t-on l'affinité Ag-Ac? | Ac + Ag <-> Ac-Ag Ka=([Ac-Ag])/([Ac]×[Ag]) entre 10^5 et 10^12 M^(-1) Kd représente la concentration, varie entre 10^(-5) et 10^(-12) M. Si Kd = 10^(-12), besoin de [Ag] = 10^(-12)M |
| Méthode immunologique : Qu'est ce que l'avidité? | Notion quantitative, prend en compte l’affinité et l’interaction entre les anticorps et les antigènes entre eux. Augmente avidité permet la stabilisation du complexe Ac-Ag Ac qui se fixe sur un autre Ac = anticorps secondaire |
| Méthode immunologique : Comment produire des anticorps polyclonaux? | Injection d’un antigène à un animal. (Injection successive). Les IgG produites se retrouvent dans le sérum qui est récupéré puis purifié par chromatographie. |
| Méthode immunologique : Comment produire des anticorps monoclonaux? | Immunisation de l’animal. Culture des cellules de l’animal. Hybridation avec cellules cancéreuses. Sélection des clones qui produisent les anticorps monoclonaux |
| Méthode immunologique : Que permet le marquage? | L'identification des complexes (Ag-Ac). Associations aux enzymes ou marquage de l’anticorps avec une molécule facilement détectable. |
| Méthode immunologique : Quels sont les deux types d'enzymes qui sont accroché à l'anticorps? | La HRP : peroxydase, produit soluble et jaune (TMB) ou produit insoluble avec précipitation brun (TAB) ou utilise du luminol. La phosphatase alcaline : produit jaune = paranitrophénol. |
| Méthode immunologique : Comment peut-on fixer deux protéines entre elles? Qu'est ce que le marquage à la biotine? | Fixation de deux protéines entre elles par cross-linker = formation d’un pont chimique Marquage à la biotine (vitamine) : réaction avec protéine primaires. Affinité très fortes avec avidine qui permet de former un complexe |
| Méthode immunologique : Qu'est qu'un anticorps primaire et secondaire? | Anticorps primaire : Ac qui reconnait un Ag. Anticorps secondaire : Ac qui reconnait le domaine Fc d’un autre Ac, c’est un anti-anticorps. L’anticorps secondaire peut être marqué par une molécule HRP, marquage fluorescent ou biotine |
| Méthode immunologique : Comment peut-être marqué l'antigène? | Par épitope tagging : ajout d’un épitope à une protéine. La séquence TAG est ajoutée en 5’ ou 3’ = petit peptide = épitope. |
| Méthode immunologique, Western blot : Qu'est ce? | C'est la séparation des protéines par électrophorèse puis transfert sur une membrane pour détecter la protéine avec un anticorps spécifique. |
| Méthode immunologique, Western blot : Comment se réalise cette technique? | Migrat° prot par champs électrique : copie du gel sur mb cellulose. Incubat° ds tampon ac Ac 1air spécifique. Rinçage mb enlève Ac non fixés. Plonge ds solut° d'Ac 2air liés à enzyme. Rinçage et révélat° présence Ac 2air par colorimétrie (obtient bande). |
| Méthode immunologique, l'immunoprécipitation : Qu'est-ce? | Précipitation d’une protéine d’intérêt. |
| Méthode immunologique, l'immunoprécipitation : Comment se réalise cette technique? | Préparat° extrait protéique cellule intérêt. Ajout Ac et incubat°: format° Ac-Ag. Ajout prot A (prot S.aureus) forte affinité pr Fc. Le complexe Ac-Ag + protéine A se fixe sur agarose Centrifugat° : ds le culot on a le complexe Ac-Ag-protéine A-agarose |
| Méthode immunologique, l'immunoprécipitation : Comment se réalise la révélation dans cette technique? | Révélation : SDS-Page avec 3 bandes : protéine d’intérêt, chaine lourde, chaine légère |
| Méthode immunologique, l'immunoprécipitation : Comment se réalise le calcul du temps de demi-vie des Ig dans cette technique? | Calcul du temps de demi-vie des Ig avec des immunoprécipitation : culture avec soufre radioactif dans méthionine radioactive. Puis ajout de méthionine non radioactive. On quantifie la radioactivité dans le culot |
| Méthode immunologique, le dosage immunologique : Qu'est-ce? | C'est la quantification du complexe Ac-Ag. Permet de savoir la quantité d’antigène de départ. |
| Méthode immunologique, le dosage immunologique : Quels sont les deux phases et que font-elles? | En phase homogène : phase liquide, formation du complexe en solution En phase hétérogène : phase solide, un des partenaire du complexe est fixé sur une phase solide (plastique) qui constitue les microplaque de filtration |
| Méthode immunologique, le dosage immunologique ELISA : Que se passe-t-il avec des anticorps en quantité limitante? | Marquage de l’Ag. Enlève Ag non marqué, permet quantifier Ag marqué. |
| Méthode immunologique, le dosage immunologique ELISA : Que se passe-t-il avec des anticorps en excès? | ELISA direct : Ag fiés et Ac qui se fixent, ajout Ac secondaire marqué. ELISA sandwich : Ac fixés et Ag qui se fixent Ac secondaire pour quantification. |
| Méthode préparative : Qu'est ce? | Ne permet pas d’avoir une caractéristique de protéine mais permet de les préparer à des quantités suffisantes pour les utiliser en méthode analytique. |
| Méthode préparative : Quels sont les deux origines de sources de protéines? | Protéines dans leur contexte naturelle Protéine recombinantes : cloner, gène code pour une protéine introduit grâce vecteur de clonage. |
| Méthode préparative : Quels sont les caractéristiques d'un vecteur d'expression dans une protéine recombinante? | Ori ; Résistance antibiotique ; MCS = site enzymes restriction ac TAG chaque côté (5’-3’) ; RBM = site ribosomes pr la traduct° ; promoteur ; point initiat° (+1) de transcript° ; codon stop ; opérateur ; gène de régulat° = permet l’induct°. |
| Méthode préparative : Qu'utilise-t-on pour préparer les protéine recombinante? | Utilisation d’enzymes de restrictions uniques pour insérer le vecteur dans le bon sens Utilisation de la PCR (amplifie fragment ADN) pour ajouter les sites de restriction en 5’ des amorces |
| Méthode préparative : Qu'est ce qu'un corps d'inclusion? | Un corps d’inclusion est un agrégat de protéine, forme insoluble = dénaturée et inactive. |
| Méthode préparative : Parmi les méthodes d'extraction, lyse des cellules, on retrouve la méthode enzymatique. Qu'est ce? | Lyse enzymatique de la paroi cellulaire utilise protéine ou lysozyme |
| Méthode préparative : Parmi les méthodes d'extraction, lyse des cellules, on retrouve la méthode mécanique. Qu'est ce que l'homogénéisateur et l'agitateur? | Homogénéisateurs : tube en verre avec piston, forces de cisaillement, pour les cellules animales Agitateur avec billes de verre |
| Méthode préparative : Parmi les méthodes d'extraction, lyse des cellules, on retrouve la méthode mécanique. Qu'est ce que la sonication? | Emission d’ultrasons dans le liquide, agitation des molécules d’eau qui passent à l’état gazeux, puis effondrement des bulles sur elles-mêmes = phénomène de cavitation, génère des ondes qui lysent les cellules |
| Méthode préparative : Parmi les méthodes d'extraction, lyse des cellules, on retrouve la méthode mécanique. Qu'est ce que la presse de French? | Presse hydraulique -> pression de 10^3 bar, ouverture d’une petite valve, liquide qui passe dans le milieu extérieur, dehors pression de 1 bar et cellules pression de 10^3 bar donc cellules explosent. |
| Méthode préparative : Qu'obtient-on après centrifugation dans le surnageant et le culot? | Dans le surnageant : protéines solubles. Dans le culot : débris membranaire + protéine insolubles. Ajout de produits stabilisants = KCl ou NaCl |
| Méthode préparative : Qu'est ce que le phénomène de saltingin? | On veut éviter l’agrégation des protéines. Ajout de sel = création d’une couche d’ions autour de la protéine. Atmosphère de centre LOMS. Les ions + vont vers les protéine et inversement. |
| Méthode préparative : Qu'est ce que le phénomène salting out? | L'eau forme une couche de solvations autour des protéines. Si beaucoup d’ions, eau solvate les ions et les protéines vont s’agrégées. |
| Méthode préparative : Que permet l'ajout de détergents? | Stabilise la protéine qui se met sur partie hydrophobe. Si détergents en grande quantité on a formation de micelles. On a une CMC = concentration micellaire critique Utilisés pour les protéines membranaires |
| Méthode préparative : On a besoin de maintenir le pH pour éviter la perte de solubilité. Quels sont les différentes solutions tampons utilisées où pH = pKa? | Bis-Tris, pKa = 6,46 PIPES, pKa = 6,76 MOPS, pKa = 7,2 TAIS, pKa = 8,06, très puissant HEPES, pKa = 7,48 Rappel : pH de la cellule = 7,5 |
| Méthode préparative : Nous savons que les protéases sont un problème car elle dégrade les protéines. Comment fait-on pour diminuer leurs activités? | Travaille à 4°C. Utilise la vitesse de travail. Ajout de tampons avec inhibiteurs de protéases : PMSF (inhibe des protéines de type trypsin), EDTA (chélateur de cation bivalents), aprotinine (inhibiteur des protéases à sérine). |
| Méthode préparative : L'oxydation peut inactiver les protéines. Comment fait-on pour l'éviter? | Travail sous atmosphère contrôler. Ajout d’anti-oxydants : DTT ; β-mercaptoéthanol (utilisation sous hotte) |
| Méthode préparative : Qu'est ce que la précipitation au sulfate d'ammonium? | Utilisation du phénomène de salting out. Utilisation de la série de Hofmaister qui donne la tendance de certains ions pour les effets de salting in/out Selon la protéine, la concentration de SO2- (sulfate d’ammonium) seuil varie pour précipiter. |
| Méthode préparative : Qu'est ce que la chromatographie? | Séparation des composés en fonction de leur partition entre une phase mobile et une phase stationnaire. A la sortie détecteur permet mesurer absorbance UV, pH ou conductivité. |
| Méthode préparative : Qu'est ce que la chromatographie d'exclusion stérique? | Séparation prot selon taille, matrice ac pores. Volume mort V0 = Vtampon entre billes, Vt = V0+Vphase stationnaire.Ve = Vélution. On a une élution isocratique. Ajout du bleu de Dextron qui permet de calculer le V0. Peut permettre de calculer le PM natif. |
| Méthode préparative : Qu'est ce que la chromatographie d'échangeuse d'ions? | Elution non isocratique. Variation force ionique de la phase stationnaire. Résine chargée positivement = échangeuse cations. Absorption des protéines sur phase stationnaire. Détachement par compétition avec des ions. Fonction du PI de la protéine et du pH |
| Méthode préparative : Qu'est ce que la chromatographie d'interaction hydrophobe? | Principe salting in/out. Ligand hydrophobe. Ajout de sulfate d’ammonium pr enlever la couche de solvatation des prot : fixation des prot sur le ligand. Décrochage : phase mobile ac [SO22-] plus faible. Les prot les moins hydrophobes sont éluées en 1er. |
| Méthode préparative : Qu'est ce que la chromatographie d'affinité? | Ligand sur la phase stationnaire reconnait la protéine. Si on change les conditions (pH, force ionique, ect), on change l’affinité, c’est l’élution non spécifique. Si on rajoute un compétiteur, on a une élution compétitive. |
Created by:
Julie.Lam
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