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Presentation
| Question | Answer |
|---|---|
| Vou começar por fazer uma introdução sobre a produção atual de resíduos e sensibilizar para os métodos de gestão desses resíduos ao nível global. | Depois vou falar das terapias com ácidos nucleicos. E de seguida começo a explicar a metodologia e resultados deste trabalho com a recuperação de queratina, preparação de hidrogéis, e libertação de dna de salmão e dna plasmidico desses hidrogéis, apresent |
| O aumento da população mundial leva à necessidade de intensificação da produção de bens essenciais | A intensificação da produção destes bens leva a um aumento da produção de resíduos dentro das variadas indústrias. Em 2020, houveram cerca de 2.13 mil milhões de toneladas de resíduos produzidos e estima-se que em 2050 esse número atinja os 3.78 mil milhõ |
| Uma das industrias que mais contribui | para o aumento dos resíduos globais é a industria agropecuária com a produção de carnes, lacticínios e respetivos resíduos de biomassa animal, como a lã. |
| agropecuária com a produção de carnes, lacticínios e respetivos resíduos de biomassa animal, como a lã. | Em 2023, cerca de 1.75 milhões de toneladas de lã foram produzidos. Cerca de 28% foram aproveitadas para a indústria têxtil. No entanto, 72% foram descartados sem perspetivas de valorização. |
| – A lã atua | como primeira barreira de defesa, sendo constituída por, em média, 90% de queratina, uma proteína com propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes |
| Tendo isto em conta, e inseridos num modelo de economia circular | o nosso objetivo é recuperar a queratina a partir da lã de ovelhas e valorizá la numa aplicação terapêutica que também engloba a entrega de ácidos nucleicos |
| Sabe-se que a informação | genética está contida nos genes dentro do cromossomas. Os diferentes 23 mil genes codificantes podem ter diversos tamanhos entre si e codificar para diversas proteínas diferentes. |
| No entanto, qualquer mutação que exista num gene codificante | poderá resultar numa proteína mutada que poderá levar a complicações de saúde seja por falta de produção de uma proteína necessária ou por excesso de produção de uma proteína mutada. |
| A terapia génica tem a intenção | de promover uma solução para as complicações promovidas por estas proteínas. Este tipo de terapia envolve a entrega de ácidos nucleicos, sejam para silenciar uma proteína como é o caso dos siRNA, microRNAS e Oligonucleótidos antisense, seja para modular a |
| – Alguns exemplos de terapias aprovadas são o | ONPATTRO que é um siRNA encapsulado numa LNP para o tratamento da amiloidose por transtirretina, |
| Spinraza | que é um ASO para o tratamento da atrofia muscular espinhal, |
| Macugen, | que entrega um aptâmero para inibir a isoforma do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF165), procurando diminuir a degenerescência de perda de visão |
| Casgevy | é a primeira terapia celular baseada na tecnologia crispr/cas9 |
| Comirnaty | entrega um mRNA que vai produzir uma proteína presente na cápside do vírus do covid, estimulando a produção de linfoticos e induzindo uma resposta imune adaptativa robusta |
| ZycovD | viral que entrega um plasmídeo de DNA |
| Neste projeto | utilizamos um vetor não viral à base de agarose e keratina para a entrega de ácidos nucleicos devido à baixa imunogenecidade, facilidade de manipulação e baixo custo |
| Para recuperar a queratina | omeçamos por limpar a lã e retirar a gordura ao submergir a lã em etanol. De seguida a lã foi seca a 50. Depois de rever na literatura quais os líquidos iónicos mais utilizados para a dissolução, fizemos um screening com 7 liquidos iónicos para avaliar |
| Todos os melhores candidatos apresentavam o | anião acetato, e eles foram o acetato de colina e o acetato de 1-etil-3-metil imidazolio e de 1-butil-3-metil imidazolio. Para o processo de otimização de dissolução, decidimos avançar com o melhor líquidos iónico com o catião imidazólio, que foi o 1-etil |
| Para a otimização da dissolução | avaliamos a eficiência de dissolução de 7, 9 e 11% de lã, usando soluções aquosas desses dois líquidos iónicos a 10, 20 e 30%, nas mesmas condições de dissolução |
| Para recuperar a queratina | solução, testamos 2 coagulantes, água e etanol e uma mistura entre os dois, a diferentes rácio entre o coagulante e asolução. |
| A melhor condição | dissolução foi 4 horas de dissolução utilizando 80 % de solução aquosa do liquido iónico acetato 1-etil-3-metil-imidazolio Para a recuperação, as melhores condições foram utilizar o rácio entre coagulante e solução de 1:1 sendo o coagulante apenas água. |
| Para confirmar o bloqueio | dos raios ultravioleta avaliamos diferentes formulações de hidrogéis com keratina e só com agarose e pudemos confirmar que os hidrogéis com queratina conseguiram bloquear quase 100% da luz emitida. |
| A estrutura da queratina | é composta por ligações de hidrogénio e por pontes de dissulfeto dos resíduos de cisteína. Assim que se promove aquecimento, na presença da solução aquosa do liquido iónico, o aniao acetato e o catio imidazólio vão conseguir romper a estrutura da queratin |
| Esta queratina foi caracterizada | por FTIR. E o espetro foi comparado com uma amostra de lã, comprovando a presença das mesma bandas nas mesmas regiões. No entanto, há algumas diferenças de intensidade nestas bandas que pode significar que o processo de dissolução possa ter alterado ligei |
| Para a preparação dos hidrogéis | utilizamos a queratina que confere atividade anti-inflamatoria, antioxidante e permite o bloqueio de raios ultra-violeta devido à presença de melanina. A adição de agarose vai permitir criar uma matriz robusta capaz de manter a resistência do hidrogel |
| Para avaliar a libertação dos ácidos nucleicos | os hidrogéis preparados foram submersos numa solução de PBS e colocados numa estufa a 37°C com agitação orbital. A cada 20 minutos, durante 3 horas, medimos a concentração do sobrenadante para avaliar a quantidade de DNA que tinha saído do hidrogel para a |
| Optámos por estabelecer a metodologia | da avaliação da libertação utilizando o DNA de salmão devido à facilidade de preparação e ao custo. Dentro dos diferentes hidrogéis testados, os hidrogéis com 3% de queratina e 0.5 % de agarose e 1.0 % de agarose e o hidrogéis com 4.5 % de queratina e 1. |
| Para a preparação de DNA plasmidico | utilizamos bacterias escherichia coli resistentes à ampicilina. Começamos por inocular as placas com estas bactérias, de seguida uma pre-fermentaçao. Uma certa quantidade desta pre-fermentaçao foi transferida para um meio maior para continuar a fermentaçã |
| A cinética de libertação do DNA plasmidico | foi idêntica à libertação de DNA de salmão. Concluimos que os hidrogéis com 0.5 % de agarose e 3.0 % de queratina conseguiram libertar a quantidade total do DNA. Já os hidrogéis só com agarose apenas atingiram valores de cerca de metade. Indicando assim q |
| Deste modo, | conseguimos demonstrar um processo sustentável de recuperação de queratina a partir de um resíduo, e valorizar a queratina para aplicações biomédicas |
| No futuro pretendemos | recuperar o liquido iónico e reutiliza-lo, avaliar a atividade citotóxica do hidrogel, fazer outro tipo de caracterizações do hidrogel e avaliar as vias de adimistração |
| Os veículos de entrega podem dividir-se | em vetores virais ou não virais. Os vetores virais como o nome indica, recorrem à tecnologia e morfologia dos vírus para replicarem a sua informação genética. Estes incluem Adenovirus, vírus adenoassociados ou lentivírus ou retrovírus. No entanto, e devid |
| De seguida avaliamos | resistência à compressão de vários hidrogéis. Concluimos que hidrogéis com maior concentração de agarose apresentam um valor médio maior do modulo de young, indicando uma maior resistência compressão. No entanto, na presença de queratina, estes mesmo hidr |
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