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enzimologia parcial
| Question | Answer |
|---|---|
| ensayo enzimatico | metodologia experimental que me permite medir la activ de una enzima , es decir la vel a la q trabaja |
| como se mide la aparicion de prod | metodos espectofometricos , floureimetricos , radiometricos , cromatograficos , electroquimicos |
| caracteristicas ensayo enz | - especificidad :para medir únicamente la act de la enz de interés sin interferencia de otras enzimas o prot de la muestra - alta sensibilidad para detectar incluso pequeñas cantidades de activ - alta precision - ser conveniente metodologicamente |
| tipos de ensayo | continuo /discontinuo directo / indirecto |
| continuo | : se realiza una lectura de la actividad enzimática monitorizando la formación del producto o desaparición del sustrato a tiempo real |
| discontinuo | se realiza una parada en la reaccion enzimática a distintos tiempos y posteriormente se determina la concentración de sustrato o de producto. |
| como parar en ensay discontinuos | Añadiendo una sustancia desnaturalizante (tricloroacético) • Calentando la reaccion a alta temperatura • Cambiando drásticamente el ph de la reaccion • Añadir secuestradores de metales (si es metaloenzima) como el EDTA |
| ventajas desvenrajaws enayos discontinuso | vent: detectar productos con tecnicas mas sensibles : detect activ enz muy bajas desvent: mas equip y personal especializado |
| factores q aqfectan a un ensayo enz | 1 ph 2 temp 3 grado oxid 4 metales pesados 5 proteasas 6 polaridad del medio 7 sust interferentes |
| con q controlas ph | con sust tamponadoras , tampon con un pk parecio al ph optimo d la enzima tris ph basico fofatos neutro acido aceticoacetato ph acido |
| como controlamos la temp en los ensayos enz | baños termostatizados o dispositivos petier |
| grado oxid de enzima | enzimas fuera de su ambiente natural pueden oxidarse y fromar agregados proteicos o puentes difsulfuro (cisteina al oxidarse el sh) alterean su estructura y actividad añadir agentes reductores : DTT CISTEINA , GLUTANOL REDUCIDO |
| presencia de metales pesados | sh reacciona con metales añadir quelante de metales como edta |
| proteasas | se liberan al hacer la ruptura (homogeneizado) pa evitar q actuen , añadir inhib de proteasas como PMSF |
| polaridad del medio | es la presencia o ausencia de iones afecta a la estabilidad y actividad de enzimas añadimos sust para aumentar o disminuir la polaridad del medio si es muy polar de alta f ionica nacl kcl si eshidrofobico apolar , glicerol dmso |
| presencia sust interferentes | (sustratos no deseados, otras enzimas, ensayo en blanco (sin sustrato). pa detectar formación de producto no relacionada con la enz de interés. 2. Diluir el extracto pa que la interferencia sea mínima. 3. Purificar parcialmente la enzima |
| que es la curva de avance de la reac | como varia la concentración de producto y sustrato respecto al tiempo en una reaccion |
| k cat constante catalitica numero de recambio. | pendient de la recta vel cat frente a [E] parámetro cinetico que informa sobre el numero de reacciones que se producen por unidad de tiempo en cada centro activo. Se calcula midiendo las v inicales a diferentes concentraciones de enzima |
| activ enz absoluta | actividad enzimática absoluta es la cantidad total de producto generado o sustrato consumido por una enzima en un tiempo específico, generalmente medida en unidades de actividad (U). |
| activ enz especific | act enz absoluta 7 mg totales de proteina |
| orden de reaccion | parámetro que permite conocer la dependencia de la velocidad de una reacción en función de otro parámetro (ej: como depende la velocidad en función de la concentración de los sustratos). |
| cinetica enzimatica | Actividad de la enzimología dedicada al estudio de la tasa de reacción (=velocidad) a la que ocurre una reacción enzimática |
| si tengo la grafica velocidad conc de sustrato lineal | monosustrato , dependencia lineal |
| como es la tasa de reac en enz michaelianas | a hipérbole con dos segmentos muy bien diferenciados. Su orden puede variar bajas concentraciones de sustrato orden 1 y a altas orden 0 |
| postulados michelis menten | 1. 2 eventos durnate catalisis : Asociación reversible de la enzima al sustrato b. Transformación del complejo enzima-sustrato en producto 2. 2 periodos : estacionario y preestacionari |
| limites ec michaelis | 1. conc prod menor q sustrato 2. estado estacionario , todos los ES formados 3. con enzima menor q sustrato , sustrato en exceso |
| tipos de metodos de linealizacion | lineweaver burk eadie hofstee hanes |
| factores q afectan a la reac eniz | ph temperatira solventes organicos |
| inhibidor | sustancia que provoca una interferencia en la catálisis enzimática, provocando un descenso o abolición completa de la velocidad de reacción de una enzima |
| como interfiere un inhib en la catalisis | interaccinando con el c activo de una enzima o el centro alosterico |
| el inhib desnaturaliza la enzima ? | no |
| importancia inhibidores en la naturaleza | papel defensivo y papel fisiologico en la regualcion del metabolismo |
| ejemplos del papel defensivo de los inhibidores | compuestos organicos q sintretizan plantas pa defenserse (glicoalcaloides) inhib de la acetilcolinesterasa proteinas inhibidoresas(kunitz) como el inhib de la tripsina , factor antinutricional botrojaracina (viboras) |
| tipos de inihb | alostericos / isos tericos reversibles /irrev |
| si modifica quimicamente a la enzima , inhib de tipo y ejemplo | irreversible organofosforados , producir una fosforilacion |
| tipos inhib | reversible: competitiva , acompetitiva , no competitiva , inhib por sustrato irrev: mixta (sustrato suicida) |
| donde se fija el inhib en la inhib competitiva | centro activo , compitiendo con el sustrato por unirse aumenta km pq disminuye la afinidad enzima por sustrato vmax no cambia |
| donde se fija el inhib en la inhib no competitiva | no compite por el sustrato por el centro activo por lo q se fija en el centro alosterico puede unirse al complejo E o ES no afecta la km pero si la vmax , la reduce |
| donde se fija el inhib en la inhib acompetitiva | unicamente al complejo ES afecta tanto a la km como a la vmax , disminuyen las dos , es decur aumenta la afinidad enzima sustrato pq estabiliza el complejo es |
| inhib por sustrato | sustrato en exceso --> inhibidor se une al centro alosterico ademas de al cent activo provocando cambios conformacionales q afectan a la vel |
| como se ve una grafica de un inhib por sustrato | hiperbola cuadratica donde se ve un minimo q represeta la concentracion de sustrato optima |
| inhib mixta , por sustrato suicida | el sustrato no es inhib perse , se une al centro activo la E le transforma en una molecula reactiva reacciona con el centro activo , modificando covalentemente a la E e irreversiblemente , inactivandola |
| para q es importante regular la activ enzimatica | pa optimizar los recursos y mantener un estado ordenado economia cel , evitar gasto energetico innecesario responder variaciones ambientales |
| tipos de regulacion | reg transcripcional reg covalente irreversible :proteolisis reg covalente rev: fosforilacion met , acetilacion reg por isoenzimas reg por sist multienzimaticos (asoc a membr, complejos multienz , polipeptidos multienz) reg alosterica |
| tecnologia enzimatica | uso de la actividad de las enzimas para resolver problemas técnicos, industriales o de producción. |
| fuente procedencia de enzimas y ejemplos | 50 % hongos : celulasa , lactasa 33 bacterias :glucosa isomerasa 8animales:catalasa , quimiotripsina , lipasa 4 plantas : alf y bet amilasa |
| pq se usan los microorganismos como fuente de enzimas | -baratos -medio de crecimiento batrato -contenido predecible y controlable porq son simples - menos sust nocivas en sus tejidos q en los de animales , plantas |
| como se cultivan microorganismos a nivel industrial | en contenedores llamados fermentadores industriales , s donde se le proporciona al microorganismo la temperatura adecuada, nutrientes, O2 (si es aeróbico) y pH adecuado. Un medio tiene que contener N S C. |
| Para proceder a realizar una producción industrial hay que tener en cuenta | 1. q la enzima la produzca un microorg seguro 2. forma de obtenerla , metodo de cultivo y aislamiento 3. si se usa movil o inmovil 4. si hay q purificarla (fines medicos) |
| que quiere decir que la produccion de enzimas debe de ser economica | crecimiento facil y en un medio economico tratar de q la expresion sea constitutiva y si no q sea de facil induccion pref produccion extracelular de la enz , pa no romperlo debe tener actividad conocida , ser estable en el tiempo y almacenamiento |
| cuando se usa un medio de cultivo definido | fines analiticos o medicos |
| 3 ejemplos de medio de cultivo para la produccion de enzimas ¿son definidos? | 1. molasas 2. agua de cocimiento del maiz 3. salvado de los cereales |
| agua de cocimiento de maiz | es el residuo de la molturacion humeda del maiz para separar los componentes principales del grano :almidon prot fibra y lipidos steeping - incubar el grano en agua caliente , obtienes liquido rico en nutrientes (medio) solucion bisulfito + maiz |
| molasas | se obtiene de la industria azucarera , a partir de caña de azucar remolacha y una. ricas en minerales y carbono residuo denso cuando quitas la porcion cristalina |
| salvado de los cereales | idnustria harinera m se puede usar para la ferm en estado solido , para purificar la enzimas |
| ¿que ocurre si la enzima d interes no es de origen microbiologico? | manipulacion genetica -->expresion heterologa de la enzima en un vector de expresion |
| como se consigue la expresion heterologa de una enzima | manip genetica cortamos el gen con enz de retriccion ligasa lo unimos la plasmido creando un vector recombinante transformacion bacteriana (bacterias adquiren adn exogeno ) por choque termico o electrico |
| transf bacteriana y tipos | es el fenomeno por el cual bla sbacterias son cpaces de adquirir adn exogeno , por choque termino : incubando con ca que las hace susceptibles , y calor 45gr choque electrico: generando poros temporales pro dnd pasa el plasmido a la bacteria |
| def de purificacion enzimatica | procesos más críticos y complicados en enzimología, debido a que requiere varios pasos técnicos, y puede resultar en una cantidad muy pequeña de enzima purificada después de muchas etapas, lo que obliga a repetir el proceso |
| purif enz | se utiliza para aislar enzimas específicas a partir de mezclas biológicas, como extractos de células o tejidos. implica múltiples pasos técnicos, como la separación y el refinamiento de la enzima de interés, para obtenerla en su forma más pura posible. |
| porq es complicado purificar enzimas | pq las sacas de su sitio nativo , manteerla estable acompañada d contaminantes agregados moleculares sensibilidad a condiciones externas |
| que debemos plantear al extraer y purificar una enz | a. material de partida b. metodo de ruptura c. ensayo d. tecnicas separativas e. criterio de pureza |
| tecnicas separativas | 1. cromatograficas : filtracion , intercam ionico , adinidad x ligando 2. solubilizacion o insolub : precip por salado , cambio disolvente , punto isoelectrico 3. eliminacion de contaminantes :filtracion o dialisis |
| que pasa con la activ especifica en una purif | tiene q aumentar |
| como tiene que ser un ensayo de actividad enzimatica en un proceso de purificacion | facil de realizar comaprativo , siempre en las mismas condiciones sustrato barato , estable , y en saturacion siempre pa q no dependa de su conc y este en vmax |
| que tener en cuenta al elegir la fuente de la enzim para una purificacion | elegir la fuente donde la enzima sea mas abundante tiene que estar fresca , no congelar |
| clasificacion de las enzimas segun su localzacin | 1. en solucion verdadera ( citoplasma o medio extracel ) se quedan en el osbrenadante 2. asociadas a estructuras cel (mitoc , nucleos) pueden estar en solucion dentro de la etructura cel o asociados al pmaterial lipoproteico insoluble |
| cual es el primer paso pa extraer una enz | ruptura cel por homogeneizado pero antes meter en un medio de extraccion pa proteger la aciv enz |
| metodos de homogenizacion y tipos de tej | mecanica - tej blandos veg y animales , sonica - eritrocitos bacterias y levaduras termica - eritrocitos bacterias y cultivos cel |
| medios de extraccion: | soluciones tamponadas bajas temperaturaws para evitar degrad agentes protectores inhib de proteasas |
| centrifugacion diferencial | para separar los componentes del homogeneizado segun peso y tamaño |
| de que hay que asegurarse tras el centrifugado ante de purificar | elegir la fraccion q tenga mas actividad asegurarse de q la enz es soluble y si no lo es usar detergentes |
| tecnicas mas frecuentes en la purificacion de enzimas :tecnicas separativas segun caract fisicoqumicas | cromatografia en capa fina cromatografia en columna dialisis ultrafiltracion |
| catalisis enzimatica | disciplina de la enzimología que estudia los mecanismos por los cuales las enzimas favorecen la reacción de los sustratos hasta productos y determina los eventos que ocurren en el centro activo de una enzima. |
| cofactores | moléculas de naturaleza no proteica , termoestables y de bajo peso molecular. Proporcionan nuevos residuos químicos a las reacciones enzimáticas. Por ejemplo el NAD |
| dif entre coenz y grupo prostetico | coenz union debil y se liberan despues de la catalisis grupo prostetico union fuerte covalente queda unido |
| con q tecnica difrenciamos entre coenz y grupo prostetico | con dialisis , si se separan o n o |
| como pueden ser los cofactores | organicos e inorganicos |
| cofactores organicos | pueeen ser coenz o grupo prosteteico |
| que les pasa a los cofactores organicos y dime alguno | q sufren una modificacin quimica tras la accin enzimatica por lo q deben ser regenerados para mantener la concentracion de estos TPP FAD NAD coA |
| dime algun cofactor inorganico | iones metalicos como mg fe cu zn |
| Como se estudia el mecanismo de acción de una enzima? | 1 Ensayos de inhibición 2 Ensayos de cambio de ph 3 Detección de intermediarios 4 Estudios cristalográficos 5 Modificaciones qumicas de las cadenas laterales de aa del centro catalitico 6 Mutagénesis dirigida |
| 1. ensayos de inhibicion | en presencia de uns sustanci inhibidora , inhbidor competitivo , analogo estructural al sustrato para que bloquee el centro activo |
| 2. ensayos de cambios de ph | para ver la dependencia de la actividad con el ph y ver si los aa de catalisis son ionizables |
| 3. deteccion de intermediarios | si es estable lo podemos aislar , si no es lo suficientemente estable podemos usar tecnicas como espectroscopia y si es inestable lo atrapamos con metodos quimicos o fisicos |
| 4. estudios cristalograficos , cual es su limitacion | para observar los contactos entre el sustrato y los aa del centro activo el tiempo de analisis tiene q ser inferir al tiempo de reaccion hacerlo a bajas temperaturas para que disminutya la velocidad |
| 5. modif quimicas en las cadenas laterales de aa | si esa cadena esta involucrada en la catalisis y la modificamos , cambiara la actividad se hace con DERIVANTES limitacion :igual no disminute la vel por eso |
| 6. mutagenesis dirigida y por que aa | si un aa involucrado en catalisis es mutado por otro ,a fecta a la activ enzimatica elegir el aa proximo al centro catalitico y mas conservado entre especies |
| ribozima | thomas cech |
| abzima | william jencks |
| estructura lisozima difraccion rayos x | david philips 1965 |
| fisher | llave cerradura |
| pauling | modelo estado de transicion |
| koshland | modelo ajuste inducido |
| estructura 3d carboxipeptidasa a | william lipscomb |
| linealiz | lineweaver burk eadir hofstee hanes |
| alosterismo | MWC monod wiman changeaux KNF koshland nemethy filmer |
| cristalizacion de la primera enzima y cual fue | la ureasa por james summer en 1926 |
| glicoalcalicoides | compuesto organico que sintetizan las plantas pa protegerse de los depredadores , inhibe la acetilcolinesterasa |
| botrojaracina | inhibe la trombina (agente plaquetario ) viboras |
| insecticidas 4 familias | organofosforados organoclorados carbamatos piretroides y piretrinas |
| sulfamida | es un antibiotico bacteriostatico de amplioespectro compuesto analogo del acido para aminobenzoico , esencial para la sintesis de acido folico , esencial para la sintesis de ac nucleicos inhib competitivo , analogo estructural |
| ac clavulaico | con el antibiot blactamico inhibe a l ab lactamasa inhib por sustrato suicida |
| sildenafilo | viagra , inhibe a la fosfodiesterasa 5 pa q no degrade el gmp ciclico |
| gases nerviosos | tabun sarin y soman , son organofosforados , inhiben a la acetilcolinesterasa irrev |
| cianuro de hidrogeno | forma complejos estables con iones emtalicos de metaloenzimas inhibiendolas afecta mucho a la citocromo c oxidasa , ultima enz de la cad de transprote electronico |
| sustancias benzoilureas | inhibidores de la quitina sintasa , frenan la sintesis de quitina , deformaciones en el exoesqueleto , y disminuye su resistencia |
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