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electroforesis
| Question | Answer |
|---|---|
| la mayoría de las biomoleculas tienen cargas cuya magnitud depende del: | ph del medio en el que se encuentren , a causa de esto, pueden desplazarse cuando se vean sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesto al de la molécula |
| qué tipo de carga tienen las proteínas y los ácidos nucleicos? | las proteínas tienen carga positiva y negativa y los ácidos nucleicos tienen solamente carga negativa , por su esqueleto de fosfatos |
| en que consiste ? | los ácidos nucleicos migran hacia el polo positivo y en el caso de las proteínas se realiza un pretratamiento con detergentes , como el disulfato de sodio que les confiere carga negativa y migran hacia el polo positivo. |
| principio de la electroforesis | consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa , según su peso molecular o tamaño , movimiento generado por el campo eléctrico. |
| importancia de la electroforesis | supone una parte importante de procedimiento sistemático del análisis , separación , Purificación , preparación de los ácidos nucleicos y las proteínas. |
| elementos necesarios para una electroforesis | -carmara de electroforesis , gel de agarosa o acrilamida , buffer de corrimiento ,marcador de peso molecular , trasiluminador ultravioleta, los epitransiluminadores ,Buffer de carga. |
| camara de electroforesis | es un dispositivo que permite crear un campo eléctrico alrededor de un gel donde se depositan las muestras. |
| en donde y como se crea el campo? | este campo se crea dentro de una solución amortiguadora en la que se encuentra sumergido el gel que contienen las muestras , el alto contenido de electrolitos permite la transmisión de la corriente eléctrica , manteniendo el ph estable. |
| como funciona la camara? | la camara cuenta co dos polos que se conectan a una fuente de energía. en las cámaras de electroforesis vertical el polo positivo esta en la parte inferior y en la cama de electroforesis horizontal se encuentra en uno de sus extremos. |
| gel | el soporte idoneo es un gel semisolido o gelatinoso , compuesto por polímeros que forman una especie de malla o microporos tridimensionales a través de los cuales avanzan las moléculas , según su peso molecular , lo que permite la separación por tamaño. |
| que gel se utiliza para los ácidos nucleicos y para la proteínas? | para la separación de ácidos nucleicos se usan geles de agarosa o acrilamida y para proteínas solo de acrilamida. |
| geles de agarosa , que es la agarosa? | es un polisacarido extraído de las algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado solido a temperatura ambiente y disolverse fácilmente a temperaturas de 50-60 grados y se solidifica cuando se enfría formando un gel altamente poroso. |
| como se elabora el gel? | -se pesa la cantidad de agarosa requerida , se disuelve en una solución amortiguadora de la misma composición y concentración que le buffer de corrimiento y se calienta hasta formar una solución. |
| ventajas sobre la acrilamida | la agarosa no es un compuesto tóxico y permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados , según la concentración de agarosa que se emplee. |
| desventajas sobre la acrilamida | su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida |
| tamaño de los poros de la matriz de gel | depende de la concentración de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido , esto es , a mayor concentración , menor tamaño de los poros y viceversa. |
| conformación distinta de la misma molécula | ej: un plasmido tiene tres conformaciones distintas , la superenrotlada , la semi relajada y una relajada. |
| importante antes de la electroforesis | la linearizacion y la eliminación de estructuras secundarias por desnaturalización de la muestra |
| dato extra: | la concentración de agarosa mas utilizada para electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5 a 2 porciento. |
| geles de acrilamida | es un polimero sintetico , termoestable , incoloro y químicamente inerte por estas propiedades pueden generar geles con un amplio intervalo de tamaños de poro. |
| el gel de acrilamida es el resultado de: | la polimerizacion quimica de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. |
| que determina el tamaño de un poro en gel de acrilamida? | esta determinado por la concentración total de acrilamida presente , que se maneja en una proporción de 19:1 regulando la concentración de ambas y su proporción. |
| ventajas del gel de acrilamida | - es capaz de soportar mayores voltajes que la agarosa -es susceptible de teñirse por varios procedimientos -puede desteñirse en caso necesario |
| que hacen los geles de acrilamida? | -los geles de acrilamida pueden utilizarse para extraer fracciones separadas( bandas) o desecados para su exposición radiográfica y registro permanente. -LA ELECTROFORESIS CON GELES DE ACRILAMIDA SIEMPRE SE REALIZA EN CAMARAS VERTICALES |
| que gel se usa para cuantificar las proteínas? | el gel de acrilamida es el gel indicado para la separación de las proteínas gracias a la fricción de las moléculas de proteina con la estructura del gel. |
| electroforesis de proteinas | emplea geles de acrilamida de dos capas de gel a diferente concentración de acrilamida , un gel superior o concentrado y un gel inferior de separación o de resolución para la correcta separación de las proteínas. |
| buffer de corrimiento es de la misma composición y ph que el buffer con el que se prepara el gel de resolución , ya sea de agarosa o acrilamida. | este proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica. y mantiene el ph sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. |
| en el caso de los ácidos nucleicos , pueden emplearse: | TBE O TAE, estos son buffer, como buffer de corrimiento. |
| de que se encuentra hecho el buffer de TBE? | Contiene tres base , acido borico , EDTA( acido etilendiaminotetraacetico), se maneja a un ph de 7.2 |
| de que esta hecho el buffer TAE? | Contiene tres bases , acido acetico , EDTA( acido etilendiaminotetraacetico), ajustado a ph 8.5. |
| marcador de peso molecular | son moléculas de adn o proteinas que permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis. |
| trasniluminador ultravioleta | transmite un espectro de luz ultravioleta a través de la muestra excitando la molécula cromogenica que emite energía fluorescente que permite visualizarla . |
| los epitransiluminadores( 365 , 480nm) | generan la emisión visible por fluorescencia igual que el transiluminador pero a diferencia de este , la fuente de energía se encuentra relajada y no pasa a través de la muestra. es efectivo en geles muy densos |
| existen dos maneras de realizar electroforesis: | de forma horizontal y vertical. |
| electroforesis horizontal | se lleva acabo en geles de agarosa para ácidos nucleicos ( leer lo de la pagina) |
| electroforesis vertical | este tipo de electroforesis se lleva a cabo exclusivamente con gel de poliacrilamida y se utiliza para proteínas o ácidos nucleicos de pequeño tamaño. |
| procedimiento para una electroforesis | 1. preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida. 2. mezclar la muestra a analizar con un buffer de carga adecuado, 3. cargar las muestras en el gel, 4. realizar la corrida electroforetica al voltaje pertinente , 5. visualizar ac. |
| electroforesis de proteinas | el metodo mas empleado para electroforesis de proteínas se lleva acabo en un sistema discontinuo , es decir , un gel conformado por dos geles de poliacrilmida , siendo uno de resolución y otro de comportamiento que difieren en su concentración y ph. |
| geles de acrilamida en acido nucleicos | para ácidos nucleicos solo se tiene una fase , conformada por el gel de resolución , donde las moléculas de ADN migraran , generando un patrón electroforetico , según si tamaño. |
| el APS | Genera radicales libres , por lo que es un indicador de la reacción de la polimerizacion que finalmente forman el gel |
| el TEMED | funciona como como otro iniciador de polimerizacion |
| aplicaciones de la electroforesis | alguno de los usos de la elctroforesis para ácidos nucleicos en geles de agarosa son determinar los tamaños moleculares de los ácidos nucleicos, analizar los fragmentos cortados con enzimas de restricción , comparar los tamaños de distintos tipos de adn. |
| aplicaciones de la electroforesis 2 | aislar y recuperar fragmentos de ADN purificados para clonaciones moleculares y analizar productos de por , etc. |
| aplicaciones electroforesis 3( en el caso de las proteínas) | la electroforesis se aplica para la identificación de fracciones proteicas o proteínas particulares por tamaño , como es el caso de la elctroforesis de globulinas , o proteínas sericas , pero sobretodo, para la identificación de moléculas particulares. |
| aplicaciones electroforesis 3( en el caso de las proteínas) | empleando posteriormente una reacción anrgenoanticuerpo especifica en la técnica de western blot |
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yisa