Help
Options
Didn't know it?
click below
click below
Knew it?
click below
click below
Don't Know
Remaining cards (0)
Know
retry
shuffle
restart
0:00
Embed Code - If you would like this activity on your web page, copy the script below and paste it into your web page.
Normal Size Small Size show me how
Normal Size Small Size show me how
Immunologia - ĆW4
ELISA, cytometria przepływowa
| Question | Answer |
|---|---|
| ELISA | enzyme-linked immunosorbent assay |
| Czym jest ELISA? | Jest to test immunoenzymatyczny służący do wykrywania określonych antygenów w materiale badanym przy wykorzystaniu specyficznych przeciwciał. |
| Jakie materiały można badać ELISĄ? | Surowica krwi, płyny ustrojowe, mocz, medium po hodowli komórkowej, homogenaty tkankowe |
| Na czym polega ELISA? | W wyniku oddziaływania antygen-przeciwciało dochodzi do powstania trwałego kompleksu, którego ilość mierzona może być spektrofotometrycznie, dzięki zastosowaniu enzymów. W teście wykorzystuje się przeciwciała skoniugowane z odpowiednim enzymem. |
| Jakie enzymy wykorzystuje się w ELISIE? | Peroksydaza chrzanowa (HRP), fosfataza alkaliczna (AP). |
| Jakiego typu testem jest ELISA? | Test ELISA jest testem jakościowym (wykrywanie antygenu w mieszaninie) oraz ilościowym (oznaczanie stężenia). |
| Zalety ELISA | Szybkość, czułość, możliwość analizy wielu próbek jednocześnie |
| Gdzie wykorzystywane są testy ELISA? | Podstawowy test kliniczny stosowany w badaniach naukowych i diagnostyce np. wykrywanie obecności przeciwciał w surowicy (testy alergiczne, testy na obecność wirusa HIV), wykrywanie obecności przeciwciał markerów nowotworowych, hormonów. |
| Jakie istnieją rodzaje testów ELISA? | Bezpośredni (Direct ELISA), pośredni (Indirect ELISA), „Sandwich ELISA” (może być pośredni i bezpośredni), test ELISA –kompetycyjny (c-ELISA) |
| Bezpośrednia ELISA? cz.1 | Płytka jest opłaszczana antygenem. Następnie dodawane są znakowane enzymem przeciwciała specyficzne względem poszukiwanego antygenu. Przeciwciała specyficznie łączą się z antygenem, niezwiązane przeciwciała są wymywane. |
| Bezpośrednia ELISA? cz.2 | Następnie dodawany jest roztwór substrat/chromofor. Skoniugowany z przeciwciałami enzym katalizuje reakcję w efekcie której powstaje barwny produkt co analizowane jest za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych |
| Zalety bezpośredniej ELISY | Szybka metoda, wykorzystuje jeden rodzaj Ab, brak niespecyficznych wiązań pochodzących od przeciwciał II rzędowych |
| Wady bezpośredniej ELISY | W celu wykrycia różnych antygenów, potrzebne są różne (specyficzne względem danego antygenu) Ab znakowane enzymem. Tworzenie takich znakowanych przeciwciał jest pracochłonne, a wiązanie chemiczne enzymu do Ab może osłabić wiązanie przeciwciał z antygenem. |
| Pośrednia ELISA? cz.1 | Płytka jest opłaszczana antygenem. Podczas inkubacji przeciwciała pierwszorzędowe wiążą się specyficznie z antygenem. Przeciwciała niezwiązane są wymywane. |
| Pośrednia ELISA? cz.2 | W kolejnym kroku dodaje się przeciwciała drugorzędowe znakowane enzymem, które wiążą się z przeciwciałem pierwszorzędowym na zasadzie rozpoznania izotypu. Niezwiązane przeciwciała są wymywane, a następnie dodawany jest roztwór substrat/chromofor. |
| Pośrednia ELISA? cz.3 | Koniugowany z drugorzędowymi przeciwciałami enzym katalizuje reakcję w efekcie której powstaje barwny produkt co analizowane jest za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych. |
| Zalety pośredniej ELISY | Ab pierwszorzędowe nie jest znakowane, dlatego koniugowany enzym nie zaburza ich wiązania się z antygenem. Większa immunoreaktywność pierwszorzędowych Ab, większa intensywność sygnału |
| Wady pośredniej ELISY | Możliwe niespecyficzne wiązania przeciwciał drugorzędowych |
| Sandwich ELISA | Antygen umieszczony jest pomiędzy dwoma przeciwciałami. Używane przeciwciała mają powinowactwo do różnych epitopów badanego białka. Najczęściej stosowany test do wykrywania i ilościowego oznaczania poziomu antygenu w próbie. |
| ELISA kompetycyjny | Test stosowany do detekcji małych antygenów, posiadających tylko jeden epitop (np. poziomu testosteronu) lub przeciwciał. Wykorzystuje się współzawodnictwo o miejsca wiązania. Słabszy sygnał oznacza większą ilość poszukiwanego antygenu w badanej próbce. |
| W jakich wydzielinach znajduje się IgA? | W surowicy (monomeryczny), ślina, łzy, siara, śluz, pot, płyn żołądkowy (dimer). Większość IgA występuje w postaci wydzielanej. |
| Dlaczego IgA występuje w postaci wydzielanej? | Uważa się, że jest to spowodowane jego właściwościami w zapobieganiu inwazji patogenów przez przyłączanie i penetrację powierzchni nabłonka. |
| Do jakiego typu odporności należy IgA? | IgA jest bardzo słabym aktywatorem dopełniacza; dlatego też nie indukuje lizy komórek bakteryjnych poprzez układ dopełniacza. |
| Jaką ogólnie funkcję pełnią IgA? | IgA znajduje się głównie na powierzchni komórek nabłonka, gdzie działa jako neutralizujące przeciwciało. |
| Próba badana w ELISIE | IgA + Blokowanie + materiał badany + anty IgA-HRP + substrat |
| Próba ślepa w ELISIE | Anty IgA + blokowanie + bufor + anty IgA-HRP + substrat |
| Kontrola negatywna w ELISIE | Anty IgA + blokowanie + materiał badany + brak + substrat |
| Kontrola negatywna 2 w ELISIE | brak + blokowanie + materiał badany + anty IgA-HRP + substrat |
| Jak przebiega oznaczanie IgA w ślinie za pomocą ELISA? | Opłaszczanie płytki przeciwciałem anty IgA, płukanie (bufor z 0,05% Tween-20), blokowanie - BSA, inkubacja z materiałem badanym/standardem, inkubacja z przeciwciałem anty-IgA-HRP (skoniugowane z HRP), r. enzymatyczna, stopowanie, odczyt 492 nm, krzywa |
| Jakie problemy mogą pojawić się w czasie testów ELISA? | Słaby sygnał, brak sygnału, za mocny sygnał, zła krzywa standardowa, niespójne, niepowtarzalne wyniki, efekt krawędzi |
| Przeciwciała monoklonalne | Przeciwciała monoklonalne są wytwarzane z jednego typu komórek B, są specyficzne względem jednego epitopu antygenu. |
| Przeciwciała poliklonalne | Przeciwciała poliklonalne, stanowią mieszaninę przeciwciał, rozpoznają wiele epitopów jednego antygenu, co czyni je bardziej tolerancyjnymi w przypadku niewielkich zmian antygenu. |
| Czym jest cytometria przepływowa? | Metoda pomiaru komórek lub cząsteczek przepływających przez aparat w strumieniu cieczy. |
| Co jest podstawą cytometrii przepływowej? | Możliwość pomiaru właściwości poszczególnych cząstek. Komórki przepływają jedna za drugą, trafiając do komory lasera, dzięki czemu wiązka lasera trafia w pojedyncza komórkę umożliwiając analizowanie jednej komórki na raz. |
| Jak zbudowany jest układ cieczy | Układ cieczy składa się z centralnego rdzenia, przez który wtryskiwana jest próbka, zamknięta przez zewnętrzny płyn osłonowy, który zawiera szybciej płynącą ciecz (0,9% PBS). |
| Na czym polega skupienie hydrodynamiczne | Płyn osłonowy jest wtryskiwany pod wysokim ciśnieniem i dlatego porusza się szybciej. Gdy p. osłonowy porusza się, tworzy efekt przeciągania, który powoduje zwężenie próbki w rdzeniu centralnym. |
| Jakie jest znaczenie skupienia (ogniskowania) hydrodynamicznego? | Bez hydrodynamicznego ogniskowania dysza instrumentu zostałaby zablokowana. |
| Z jakich elementów składa się cytometr przepływowy? | Układ cieczy, układ optyczny, układ elektroniczny |
| Jaką funkcję pełni układ cieczy w cytometrii przepływowej? | Wprowadza materiał badany do komory lasera oraz warunkuje przepływ liniowy. |
| Jaką funkcję pełni układ optyczny w cytometrii przepływowej? | Wykrywanie światła - skupiony laser, który rozprasza światło i emituje fluorescencję, która jest filtrowana i zbierana. |
| Na czym polega detekcja optyczna w cytometrii przepływowej? | Cz. fluorescencyjna obecna w lub na cząstce jest wzbudzana przez św. lasera pochłania energię z lasera i uwalnia tę energię. Emitowane fotony przechodzą przez soczewkę odbiorczą, są rozdzielane i kierowane specyficznymi kanałami za pomocą filtrów. |
| Jaką funkcję pełni układ elektroniczny w cytometrii przepływowej? | Przetwarzanie sygnału – emitowane światło jest konwertowane na impuls napięcia, które następnie jest przechowywany w pliku do analizy. |
| Jaką funkcję pełni układ filtrów w cytometrii przepływowej? | Podzielenie światła na określone długości fal w celu ich niezależnego ilościowego pomiaru. System filtrów pozwala na odbieranie światła o różnych długościach fali przez fotodetektory. |
| Jak działają filtry optyczne w cytometrii przepływowej? | Filtry optyczne są zaprojektowane w taki sposób, że pochłaniają lub odbijają niektóre długości fali światła, podczas gdy inne transmitują. |
| Jakie parametru mierzone są przez cytometr? | Rozproszenie na wprost (FSC), rozproszenie boczne (SSC), względna wartość fluorescencji (FL) |
| FSC i SSC | forward scatter channel i side scatter channel |
| Czym jest FSC? | Światło rozproszone na wprost jest zbierane przez soczewkę. |
| Co oznacza parametr FSC? | FSC określa wielkość cząstki i może być również wykorzystana do rozróżnienia między resztkami komórkowymi a żywymi komórkami. |
| Czym jest SSC? | Światło mierzone pod kątem 90o do wiązki lasera nazywa się rozpraszaniem bocznym. |
| Co oznacza parametr SSC? | Kanał SSC dostarcza informacji o względnej złożoności (na przykład ziarnistości i strukturach wewnętrznych) komórki lub cząstki. |
| O czym łącznie mówią SSC i FSC? | Zarówno FSC, jak i SSC są unikalne dla każdej cząstki, a ich kombinacja może być stosowana do różnicowania różnych typów komórek w heterogenicznej próbce. |
| Po co w cytometrze przepływowym mierzy się fluorescencję? | Pomiary fluorescencji przy różnych długościach fal mogą dostarczyć danych ilościowych i jakościowych na temat receptorów powierzchniowych znakowanych fluorochromem lub cząsteczek wewnątrzkomórkowych, takich jak DNA i cytokiny. |
| Jakie występują detektory w cytometrze? | Detektorami są krzemowe fotodiody lub fotopowielacze (PMT). Krzemowe fotodiody są zwykle używane do pomiaru rozproszenia na wprost, gdy sygnał jest silny. PMT są bardziej czułymi przyrządami i nadają się do odczytów rozpraszania bocznego i fluorescencji. |
| Co jest źródłem światła w cytometrii? | Najczęściej lasery. |
| Dlaczego akurat lasery są wykorzystywane w cytometrii jako źródło światła? | Ponieważ, wytwarzają pojedynczą dł. fali światła (linia lasera) na jednej lub kilku oddzielnych częstotliwościach (światło spójne). Są dostępne w różnych długościach fal, od UV do far red i mają różny zakres poziomów mocy (moc wyjściowa /czas fotonu). |
| Jak zmienia się parametr FSC w zależności od wielkości komórki? | Zazwyczaj większe komórki załamują więcej światła niż mniejsze komórki. |
| Jakie typy filtrów optycznych wykorzystuje się w cytometrii przepływowej? | Long pass, short pass i band pass. |
| Jaką funkcję pełnią long pass - filtry o dalekim przepływie w cytometrii przepływowej? | Umożliwiają przepuszczanie światła powyżej odciętej długości fali. |
| Jaką funkcję pełnią short pass - filtry o krótkim przepływie w cytometrii przepływowej? | Umożliwiają przepuszczenie światła poniżej odciętej długości fali |
| Jaką funkcję pełnią band pass - filtry pasmowe w cytometrii przepływowej? | Transmitują światło w określonym wąskim zakresie długości fal (określanym jako szerokość pasma). |
| Jakie jest ogólne działanie filtrów long pass, short pass i band pass w cytometrii przepływowej? | Wszystkie te filtry blokują światło przez absorpcję. |
| Czym jest lustro dichroiczne w cytometrii przepływowej? | Filtr umieszczony pod kątem do padającego światła |
| Jaką funkcję pełni lustro dichroiczne? | Ten rodzaj filtru pełni dwie funkcje, po pierwsze, do przekazywania określonych długości fal w kierunku do przodu, a po drugie do odchylania zablokowanego światła pod kątem 90°. |
| Jak powstaje impuls elektryczny w cytometrze? | Za każdym razem, gdy odpowiednia cząstka przechodząc przez wiązkę lasera generuje sygnał, w każdym detektorze PMT generowany jest impuls. |
| Jak przetwarzany jest impuls elektryczny w cytometrze? | Impulsy odzwierciedlają przechodzenie komórki przez wiązkę laserową i sygnał generowany w każdym punkcie ścieżki komórki. Impulsy te można odwzorować przez wykreślenie sygnału w funkcji czasu. |
| Na czym polega linia odcięcia w cytometrze? | Pożądane i konieczne jest "wygaszenie" takich danych jak: światło, pył, małe cząstki i szczątki. Odbywa się to poprzez ustawienia natężenia na PMT oraz linii odcięcia. |
| Jak działa linia odcięcia w cytometrze? | Każdy impuls, który nie przekracza wartości progowej, jest ignorowany we wszystkich detektorach; każdy impuls, który przekracza poziom progowy, jest w pełni przetwarzany przez elektronikę. |
| Co to jest "event" w cytometrii? | Generacja pulsu przez cząsteczkę w momencie gdy jest w pełni oświetlona i wytworzy maksymalną ilość sygnału optycznego. Gdy cząstka wypływa z wiązki laserowej, prąd wyjściowy PMT spadnie z powrotem do linii podstawowej. |
| Czym jest próbkowanie w cytometrii? | Próbka impulsu rejestruje sygnał w jednej chwili i zapisuje go jako wartość cyfrową. Razem te próbki reprezentują cały impuls i sygnał optyczny z cząstki. Elektronika określa ilościowo cały puls, obliczając jego wysokość, powierzchnię i szerokość. |
| Jakimi parametrami charakteryzuje się puls w cytometrii? | Wysokość, powierzchnia i szerokość. |
| Co mówi o próbce wysokość i obszar pulsu w cytometrii? | Wysokość i obszar, są używane do pomiaru intensywności sygnału, ponieważ ich wielkości są proporcjonalne do liczby fotonów, które oddziałują z PMT. |
| Co mówi o próbce szerokość pulsu w cytometrii? | Szerokość jest proporcjonalna do czasu, w którym cząstka spędzi w komorze lasera i może zostać użyta do rozróżnienia dubletów (czyli dwóch cząstek przechodzących przez laser tak blisko, że system przypisał je do jednego pulsu i zdarzenie) z singletów. |
| Po co stosuje się wzmocnienie logarytmiczne w cytometrii? | Zwykle używane do badań fluorescencji, ponieważ rozszerza słabe sygnały i kompresuje silne sygnały, co powoduje, że rozkład jest łatwy do wyświetlenia na histogramie. |
| Co to jest parametr w cytometrii? | Pomiar z każdego detektora. Każdy parametr może być wyświetlany jako wysokość, obszar i szerokość na histogramach i wykresach punktowych w oprogramowaniu cytometrii przepływowej. |
| Co jest celem markera fluorescencyjnego cytometrii? | Bezpośrednie nakierowanie na interesujący epitop i umożliwienie pomiaru jego właściwości biologicznych i biochemicznych. |
| Jakie jest zastosowanie markerów fluorescencyjnych cytometrii? | Np. identyfikacja i ocena ilościowa różnych populacji kom., receptorów na powierzchni kom. lub organelli wewnątrzkom.; sortowanie kom.; eksperymenty z napływem Ca2+, określanie zawartości k. nukleinowego; pomiar ak. enzymatycznej, badania nad apoptozą. |
| Co może być markerem fluorescencyjnych w cytometrii? | Skoniugowane z fluoroforem przeciwciało |
| Kiedy stosuje się kompensację? | Nakładanie się widm. |
| Czym jest kompensacja fluorescencji? | Analiza danych, która oblicza, ile zakłóceń (jako %) będzie miał fluorochrom w kanale, który nie został przypisany specjalnie do pomiaru. |
| JAkie kontrole należy wykonać w cytometrii przepływowej? | Kontrola niebarwiona, izotypowa, pojedyncze barwienie i kontrola kompensacji, kontrola żywotności, kontrola FMO, |
| Kontrola niebarwiona w cytometrii przepływowej | Kontrolę niebarwioną wykorzystuje się do określenia autofluorescencji populacji badanej oraz może być pomocna w określeniu fluorescencji tła. |
| Kontrola izotypowa w cytometrii przepływowej | Ich rolą jest zapewnienie, że obserwowane barwienie jest spowodowane specyficznym wiązaniem przeciwciała z celem, a nie artefaktem. Pozwala na określenie fluo tła. Nie należy ich używać do określania komórek pozytywnych i negatywnych. |
| Jak wykonuje się kontrolę izotypową w cytometrii przepływowej? | Wybarwiając dodatkową próbkę badanych kom. mysimi immunoglobulinami tej samej klasy, podklasy i sprzężonymi z tym samym fluorochromem co przeciwciała diagnostyczne. |
| Jakie powinny być mysie immunoglobuliny do kontroli izotypowej w cytometrii przepływowej? | Kontrolne mysie immunoglobuliny muszą być tak zaprojektowane, aby nie reagowały specyficznie z żadnym badanym antygenem. |
| Pojedyncze barwienie i kontrola kompensacji w cytometrii przepływowej | Pojedyncze barwienie ujawni poziom nakładania się widm między różnymi fluoroforami i pozwoli na usunięcie lub zrekompensowanie tego nakładania się. Pozwala na określenie poziomów kompensacji. |
| Jaka powinna być kontrola kompensacji w cytometrii przepływowej | Fluorofory muszą wykazywać tą samą jasność co komórki badane pozytywne oraz przeciwciała muszą być znakowane tym samym fluorochromem co w próbkach badanych. |
| Dlaczego należy wykonywać kontrolę żywotności w cytometrii przepływowej? | Martwe kom. w próbce mogą znacznie wpłynąć na barwienie, a tym samym na jakość danych. Dzieje się tak, ponieważ martwe komórki mają większą autofluorescencję i zwiększone niespecyficzne wiązanie przeciwciał, co prowadzi do fałszywie pozytywnych wyników. |
| Kontrola FMO (fluorescence minus one) w cytometrii przepływowej | Kontrola FMO to dodatkowe próbki wyznakowane wszystkimi przeciwciałami obecnymi w panelu z wyjątkiem jednego. |
| Po co wykonuje się kontrolę FMO? | Umożliwia ocenę niespecyficznego wiązania określonego przeciwciała. Przede wszystkim jednak kontrole FMO pozwalają ocenić efekt kompensacji zachodzących na siebie emisji fluorescencji poszczególnych fluorochromów. |
| Co to znaczy, że kontrole FMO pozwalają ocenić efekt kompensacji zachodzących na siebie emisji fluorescencji poszczególnych fluorochromów? | Ocenić rozmiar efektu rozprzestrzeniania danych (rozprzestrzenianie się danych) i określić granicę pomiędzy komórkami dodatnimi i ujemnymi dla dany antygen. |
| Na jakich komórkach występują receptory Fc? | Receptory Fc są obecne na różnych typach komórek w tym na monocytach, makrofagach, komórkach B, granulocytach i komórkach dendrytycznych. |
| Jaki jest problem z komórkami posiadającymi receptory Fc w cytometrii przepływowej? | Receptory Fc mogą powodować fałszywie dodatnie wybarwianie immunofluorescencyjne dzięki receptorom Fc wiążącym Ig. |
| Do czego stosuje się SerumBlock? | Blokuje Fc - zapobiega specyficznemu zabarwieniu bez ingerencji w odpowiednie markery docelowe. Wskazują czy wiązanie antygenu jest specyficzne. |
| Wyzwania w cytometrii przepływowej | Niektóre markery są silniej ekspresjonowane, barwniki wykazują różną int. fluo. , niektóre są dostępne tylko z określonym fluorochromem, rozlanie emisji fluo. przyczynia się do tła optycznego, co zmniejsza rozdzielczość markerów słabo ekspresjonowanych, |
| Jak układa się panel badań w cytometrii przepływowej? | Sprawdź dostępność odczynników, dopasuj fluorochromy względem intensywności świecenia zgodnie z dystrybucją markerów, oceń jednoczesną ekspresję markerów. Minimalizuj nakładanie się widma na czułość, kontrole |
| Czy można wybrać takie same fluorofory w wielobarwnej immunofluorencji? | Nie, nie można wybrać dwóch takich samych, np.: CD14-FITC i CD11b-FITC, tylko CD14-FITC i CD11b-PE) |
| Jak dobiera się fluorochromy | Użyj jasnego fluorochromu do słabo ekspresjonowanych markerów, a słabych fluorochromów do wysoko ekspresjonowanych markerów. |
| Po co wykonuje się titrcję przeciwciała? | Maksymalizacja sygnału (próbka pozytywna) w stosunku do szumu tła (negatywna populacja). |
| Co jest podstawową zasadą w analizie danych z cytometrii przepływowej? | Selektywna wizualizacja interesujących komórek przy jednoczesnym eliminowaniu wyników z niepożądanych cząstek, np. martwe komórki i śmieci. Tzw. bramkowanie. |
| Czym różnią się martwe komórki od żywych w cytometrii przepływowej? | Martwe komórki mają niższe rozproszenie FSC i SSC niż żywe komórki. |
| Co to jest bramkowanie? | Wyznaczanie obszarów reprezentujących poszczególne grupy komórek poprzez przypisanie im zakresów na osiach. |
| Immunofenotypowanie komórek krwi | Nieprawidłowy wzrost może wpływać na naturalną ekspresję markerów, co powoduje nadekspresję niektórych i niedostateczną ekspresję innych. Na tej podstawie można rozróżniać między komórkami zdrowymi i chorymi. |
| Kiedy używa się immunofenotypowanie komórek krwi? | Wspomaganie diagnozy szpiczaków, chłoniaków i białaczek. Może być również stosowany do monitorowania skuteczności leczenia klinicznego. |
Created by:
biotech6