Help
Options
Didn't know it?
click below
click below
Knew it?
click below
click below
Don't Know
Remaining cards (0)
Know
retry
shuffle
restart
0:00
Embed Code - If you would like this activity on your web page, copy the script below and paste it into your web page.
Normal Size Small Size show me how
Normal Size Small Size show me how
Tkanki - ĆW
Tkanki - ćwiczenia
| Question | Answer |
|---|---|
| Czym różni się hodowla pierwotna od linii komórkowej? | Linia komórkowa ma nieograniczoną (ciągła) lub ograniczoną (nieciągła) ilość podziałów komórkowych. Hodowla pierwotna musi być jeszcze przez pierwszym pasażem. |
| Co to jest pełne medium? | Medium, które poza składniami zawartymi w medium minimalnym zawiera także dodatkowe składniki, takie jak: antyoksydanty (np. glutation), karboksymetyloceluloza (CMC), środki selekcyjne czy media kondycjonowane. |
| Po co w trakcie preparacji fibroblastów z embrionów kurczęcia tkankę poddaje się działaniu trypsyny? | Aby zhydrolizować większość substancji międzykomórkowej, można jej także użyć, aby odkleić komórki od podłoża. |
| Jak zakłada się hodowlę pierwotną? | Materiał pobieramy z żywego organizmu (organ, tkanka), otrzymujemy tzw. eksplant. Delikatnie rozdrabniamy, traktujemy EDTA i trypsyną, komórki przynosimy na pożywkę. |
| Eksplanet | Komórki z tkanek stałych, kawałek tkanki otrzymanej z żywego organizmu. |
| Jak zbudowane są fibroblasty? | Są to komórki twórcze tkanki łącznej właściwej, pochodzenia mezenchymalnego o wrzecionowatym lub gwiaździstym kształcie, tworzą długie, cienki wypustki. |
| Jaką funkcję pełnią fibroblasty? | Syntetyzują włókniste białka macierzy zewnątrzkom. (np. kolagen, fibronektynę, lamininę), powodują rearanżację struktury tkanek poprzez produkcję metaloproteinazy macierzy zewnątrzkom., wydzielają czynniki wzrostu odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy. |
| Jak nazywa się spoczynkowa forma fibroblastów (w dojrzałej tkance łącznej)? | Fibrocyty |
| Czy fibroblasty są zdolne do ruchu? | Fibroblasty i fibrocyty są osiadłe, ale posiadają zdolność do ruchu. Częstość podziałów mitotycznych fibroblastów zwiększa się podczas gojenia się tkanki łącznej, pod wpływem czynnika wzrostu fibroblastów - FGF |
| Jak nazywają się komórki czerniaka? | Melanocyty - komórki ulegające transformacji nowotworowej. |
| Linia A375 | Adherenta linia komórkowa ludzkiego czerniaka bezbarwnikowego wywodząca się z guza pierwotnego, pochodząca z banku komórek ATCC |
| Gdzie występują mikrofilamenty? | W obrębie całej komórki, ale najbardziej skoncentrowane są w warstwie korowej i pod błoną. |
| Za co odpowiedzialne są mikrofilamenty? | Odpowiadają za pełzanie po powierzchni, fagocytozę, podział (tworzą pierścień skurczowy podczas podziału komórki). Odpowiadają za budowę mikrokosmków, kory komórki, filopodiów, lamelipodiów oraz miofibryl. |
| Jaką średnicę mają mikrofilamenty? | 7-9 nm |
| Co stanowi element podstawowy mikrofilamentu? | Cząsteczka aktyny (białko globularne) |
| Gdzie występują mikrotubule? | Biorą początek z centrum organizującego mikrotubule (MTOC - ciałko podstawowe rzęski, centrosom - zbudowany z gamma-tubulinowych pierścieni). |
| Za co są odpowiedzialne mikrotubule? | Za określanie pozycji organelli w obrębie komórki, za ukierunkowany transport wewnątrzkom., rozdzielenie chromosomów do komórek potomnych (wrzeciono kariokinetyczne), za ruch komórki lub do wprowadzania w ruch cieczy ponad pow. komórki (wici i rzęski). |
| Jaką średnicę mają mikrotubule? | 25 nm |
| Co stanowi element podstawowy mikrotubuli? | Podjednostki tubuliny |
| Jaką średnicę mają filamenty pośrednie? | 10 nm |
| Co stanowi element filamentów pośrednich? | Białka filamentów pośrednich - duża, heterogenna grupa |
| Jakie można wyróżnić strefy morfologiczne cytoszkieletu? | Szkielet błonowy - sieć białek peryferyjnych związanych z błoną, przybłonowa strefa filamentów aktynowych, dookoła jądra - otoczka z filamentów pośrednich, szkielet jądrowy, przez całą komórkę: włókna naprężeniowe (f. aktynowe), mikrotubule |
| Czym jest falloidyna? | Organiczny związek chemiczny, silnie toksyczny jad. Zaburza strukturę cytoszkieletu i funkcjonalność komórki. |
| Jak działa falloidyna? | Falloidyna silnie wiąże się z mikrofilamentami aktyny, natomiast znacznie słabiej z aktyną monomeryczną. Powoduje to znaczące zwiększenie ilości aktyny w formie filamentowej (aktyny F). |
| Do czego wykorzystywana jest aktyna? | Po wyznakowaniu fluoroforem wykorzystywana jest do lokalizowania aktyny F w cytoszkielecie komórek oraz do jej pomiarów ilościowych. |
| Czy falloidyna świeci? | Nie, należy ją wybarwić fluorescencyjnie np. izotiocyjanianemtetrametylorodaminy B (TRITC). Wtedy kompleks świeci się na żółto, lub Alexa Fluor 568, wtedy kompleks świeci na czerwono. |
| Do jakich cząsteczek wiąże się falloidyna? | Do F–aktyny. |
| Jakie są trzy etapy przygotowania próbek do mikroskopu fluorescencyjnego? | Utrwalenie komórek, permeabilizacja, barwienie (+ blokowanie) |
| W jaki sposób można utrwalić komórkę? | 3,7% paraformaldehyd w buforze PBS – utrwalenie z zachowaniem natywnej struktury białek. |
| W jaki sposób można permeabilizować komórkę? | 0,1% Triton X–100 w buforze PBS– silny detergent, częściowo rozpuszcza błony jądrowe |
| Co to znaczy permeabilizacja komórki? | Zwiększenie przepuszczalności błony cytoplazmatycznej komórek. Permeabilizację należy wykonywać w przypadku barwienia białek wewnątrzkomórkowych, aby umożliwić barwnikom penetrację poprzez błonę komórkową. |
| Fluorescencja | Rodzaj fotoluminescencji, polegający na emisji fotonu wskutek powrotu cząsteczki z singletowego stanu wzbudzonego do stanu podstawowego, czyli powstawaniu światła widzialnego w wyniku naświetlania obiektu promieniami UV, niebieskimi lub zielonymi. |
| Fluorofor | Substancje wykazujące fluorescencję |
| Naturalnie występujące w komórce fluorofory | Lipofuscyna, porfiryny, wit. A, chlorofil |
| Najczęściej stosowane barwniki fluorescencyjne | Fluoresceina, rodamina, DAPI, FITC, Cy3, Cy5, Alexa |
| Czym jest immunohistochemia? | Immunohistochemia – jest to metoda wykrywania rozmaitych substancji antygenowych w skrawkach mikroskopowych |
| Na czym polega barwienie immunohistochemiczne? | Polega na zastosowaniu przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanym składnikom preparatu a następnie systemu detekcji, tworzącego barwną, nierozpuszczalną substancję, widoczną w mikroskopie. |
| Hoest 33342 | Absorbuje UV, fluoryzuje na jasnoniebiesko, tworzy fluorescencyjne kompleksy z sekwencjami bogatymi w pary AT w podwójnym łańcuchu DNA - stabilny barwnik dla DNA, zwłaszcza w utrwalonych komórkach. |
| Jaką funkcję pełni cytoszkielet? | Cytoszkielet pełni rolę rusztowania dla wielu enzymów. |
| Kiedy struktura cytoszkieletu ulega zmianom? | Struktura cytoszkieletu ulega zmianom podczas transformacji nowotworowej, różnicowania komórek, uszkodzeń przez patogeny. |
| Jakie lampy stosuje się w mikroskopii fluorescencyjnej? | Lampa rtęciowa (wysokointensywna, nierównomierne promieniowanie) lub halogenowa (ksenonowa) (niskointensywna, równomierna). |
| Jaka jest zasada mikroskopii fluorescencyjnej? | Wykorzystuje zjawisko emisji części zaabsorbowanej energii na sposób promienisty; preparat oświetlany światłem o jednej dł. fali (w zakresie UV), filtr odcina św. wzbudzające, przepuszczane tylko św. emitowane; nie ma większych powiększeń. |
| Po co w mikroskopii fluorescencyjnej stosuje się filtry? | Aby odfiltrować światło wzbudzające od emitowanego, chodzi nam o selektywne wzbudzanie fluoroforu. |
| Czym różni się mikroskopia fluorescencyjna od zwykłej mikroskopii optycznej? | Nie poprawia zdolności rozdzielczej ani powiększeń, za to pozwala na lokalizację odpowiednio wyznakowanych składników. |
| Jaka jest zasada mikroskopu konfokalnego? | Światło, które jest wzbudzane w punktach leżących poza ogniskiem jest eliminowane przez system przysłon (pinhole) i nie bierze udziału w tworzeniu obrazu. Wynikiem tego jest obraz niezawierający składowych pochodzących z innych płaszczyzn niż ogniskowe. |
| Co to znaczy, że mikroskop działa w konfiguracji odwróconej? | Że obiektyw znajduje się poniżej naszej próbki. |
| Po co używa się laserów w mikroskopii? | Daje to monochromatyczne, skoncentrowane, intensywne światło. |
| Jakie elementy różnią mikroskop konfokalny od fluorescencyjnego? | Moduł laserowy oraz pinhole. |
| Wady mikroskopii konfokalnej | Wpływ czynników otoczenia, blaknięcie, fototoksyczność, gorsza rozdzielczość niż w mikroskopie elektronowym, wysoka cena. |
| Zalety mikroskopii konfokalnej | Odcinany jest sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, możliwość rekonstrukcji 3D, rejestracja przekrojów optycznych, brak poświaty, lepsza rozdzielczość niż mikroskopia optyczna, możliwość wizualizacji żywych preparatów. |
| Po co stosuje się pin–hole w mikroskopii? | Zastosowanie przesłony z małym otworem przed detektorem odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego obrazu. |
| Jak działa mikroskop konfokalny? | Źródło światła - laser, promień jest dodatkowo skupiany, tworząc w płaszczyźnie formowania obrazu plamkę o średnicy 0,1 um. Aby oświetlić cały preparat plamka przesuwa się bardzo szybko, kreśląc równoległe linie pokrywające cały preparat. |
| Offset | Korekta autofluorescencji tła |
| Gain | Wzmocnienie sygnału, bez zwiększania mocy lasera |
| Komórki zawiesinowe | "Pływające w medium", nie przyczepiają się do podłoża |
| Po co dodaje się ATP do buforu do lizy komórek? | ATP stabilizuje monomery aktyny-G |
| Po co dodaje się CaCl2 do buforu do lizy komórek? | Ca2+ stabilizuje monomery aktyny-G |
| Po co dodaje się DTT do buforu do lizy komórek? | Redukuje mostki C-C |
| Po co dodaje się sacharozy do buforu do lizy komórek? | Gradient gęstości niezbędny do ultrawirowania |
| Co to znaczy: trypsynizacja nieoszczędzająca? | Reakcja enzymatyczna trypsyny prowadzona na ciepło - trypsyna tnie wszystkie białko - chcemy strawić tkanki. |
| Co to jest RPMI? | Medium dla fibroblastów, zawierające witaminy, sole, aminokwasy, surowicę oraz zestaw antybiotyków. Inne komórki nie przeżyją w tym medium - tylko fibroblasty przeżyją, bo są małe wymagające i są komórkami adherentnymi. |
| O czym należy pamiętać przenosząc komórki do medium (wysiewanie)? | Temperatura odczynników musi wynosić 37 stopni. |
| Co oznacza zmiana koloru medium w hodowli komórkowej? | Oznacza zakwaszenie medium przez metabolity komórkowe - widać zużycie medium. |
| Czym jest konfluencja? | W dziedzinie kultur komórkowych jest miarą liczby komórek, wyrażona jest jako % powierzchni naczynia hodowlanego zajętego przez kom. Przykładowo 100% konfluencja oznacza, że kom. zajęły całą dostępną im przestrzeń i nie mają już miejsca na dalszy wzrost. |
| Na czym polega pasażowanie? | Pasażowanie polega na przeniesieniu komórek ze starego naczynia do nowych naczyń, zawierających świeżą pożywkę. |
| Po co wykonuje się pasażowanie? | Ponieważ kom. dzielą się mitotycznie, dłuższy okres hodowli powoduje całkowite zapełnienie naczynia hodowlanego, zubożenie podłoża i śmierć komórek. Pasażowanie linii kom. umożliwia hodowanie nowych pokoleń identycznych kom. praktycznie w nieskończoność. |
| Jak przebiega pasażowanie komórek zawiesinowych? | Pasażowanie komórek zawiesinowych polega na ich zebraniu z naczynia hodowlanego, zwirowaniu przy przeciążeniu około 200 g (zwykle przez 5–10 minut), a następnie rozproszeniu w większej ilości pożywki i przeniesieniu do większej liczby naczyń hodowlanych. |
| Jak przebiega pasażowanie komórej adherentnych? | Trypsynizacja - stosuje się w tym celu trypsynę, zwykle w stężeniu 0,25%. Trypsyna trawi białka błony kom., którymi przyczepiają się one do dna i ścianek naczynia. Gdy kom. znajdą się w zawiesinie, postępuje się z nimi tak, jak z zawiesinowymi. |
| Co należy zrobić po trypsynizacji? | Ponieważ trypsyna trawi również białka błony niezbędne do życia komórek, po ich odczepieniu dodaje się pożywkę z inhibitorem trypsyny. |
| Kiedy należy dokonać pasażowania? | Kiedy konfluencja wynosi ok. 70-80%. |
| Jak barwiliśmy tubulinę? | Przeciwciała I-rzędowe mysie skoniugowane przeciwko tubulinie β + przeciwciała II-rzędowe skoniugowane ze znacznikiem FITC |
| Jak barwiliśmy filamenty aktynowe? | Falloidyna skoniugowana ze znacznikiem Alexa Fluorofor |
| Jak barwiliśmy jądra? | Fluorochrom Hoechst (interkaluje do DNA). |
| Co można użyć zamiast tritonu+formaldehydu? | Metanolu, jednak metanol denaturuje epitopy i nie zawsze można go użyć. |
| MEM | Minimum Essential Medium |
| Odczynniki wchodzące w skład płynu hodowlanego do założenia hodowli fibroblastów z embrionu kurczęcia | MEM, glutamina, 10% surowica (FBS), antybiotyki (penicylina+streptomycyna), roztwór PBS |
| Hodowla pierwotna | Zakładane są z materiału pobranego bezpośredni z organizmu. Hodowla pierwotna musi być jeszcze przez pierwszym pasażem. Nawet komórki, które są na 1. lub 2. pasażu, ale zostały oderwane od podłoża i umieszczone w nowym naczyniu są liniami komórkowymi. |
| Po co wirujemy po zahamowaniu aktywności trypsyny? | Aby odpłukać stare, zużyte medium. |
| Czy zawsze należy wirować komórki po zahamowaniu aktywności trypsyny? | Nie, jeżeli komórki potrzebują do stymulacji swojego wzrosut wydzielanych przez siebie czynników (autokrynne przekazywanie sygnałów), lub gdy komórki ulegają mechanicznemu zniszczeniu poprzez wirowanie. |
| Czym są "białe kłaczki", które ciągną się po dnie naczynia gdy trypsynizujemy? | Agregaty komórek "polepione DNA", które wydostałosię z nadtrawionych komórek - zbyt długa trypsynizacja. |
| Co się stanie, jeżeli zbyt długo zwlekamy z pasażem? | Komórki tracą zdolność inhibicji kontaktowej - widać na murawie komórek "białe kolonie", część komórek ulega transformacji, stransformowane kom. nabywają nowych cech w porównaniu do kom.wyjścowych, szybko proliferują i z czasem wypierają kom. wyjściowe. |
| Wyposażenie pracowni komórkowej | Laminar, inkubator CO2, mikroskopy, lodówki, zamrażarki, licznik komórek (hemocytometr), palniki gazowe, mieszadła magnetyczne, wirówki,szafki na jałowe przedmioty, sterylizator do suchej sterylizacji, autoklaw do mokrej sterylizacji, łaźnie wodne |
| Po co stosuje się inkubator do hodowli tkankowych? | Zapewnia środowisko w którym kontrolowane są: temperatura, stężenie CO2 i wilgotność. Zapewnia odpowiednia pH pożywek! |
| Jakie materiały poddaje się mokrej sterylizacji w autoklawie? | Opakowane i nieopakowane narzędzia, bawełna, szkło, guma, pożywki. |
| Jak działa laminar? | Powietrze wchodzące do komory przechodzi przez flitry które zajtrzymują bakterie i zarodniki grzybów. W tej sposób wysterylizowane powietrze przepływa przez komorę w czasie pracy. |
| Zalety hodowli komórkowych | Kontrola środowiska, możliwość bezpośredniego eksperymentowania na komórkach,badania funkcji i reaktywności poszczególnych typów komórek, bezpośredniego badania interakcji komórek, powtarzalność wyników, koszt jest niższy niż in vivo |
| Jakie są najważniejsze składniki pożywek | Węglowodany jako źródło energii, aminokwasy (zwłaszcza egzogenne), witaminy zwłaszcza z grupy B, hormony i czynniki wzrostu, białka i peptydy, kwasy tłuszczowe, lipidy, cholesterol, mikroelementy: cynk, miedź, selen i żelazo. |
| Składniki surowicy istotne dla hodowli tkanek | Czynniki wzrostu, hormony, albuminy, tranferyna, czynniki adhezyjne, antyproteazy |
| Linia komórkowa | Populacja komórek powstająca z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu. |
| Po którym pasażu linia komórkowa staje się stabilna? | Po trzecim |
| Co to znaczy, że linia komórkowa jest stabilna? | Jej komórki mają określone tempo proliferacji. Linia komórkowa ma zwykle szybsze tempo wzrostu niż hodowla pierwotna. |
| Po co dodaje się EDTA do buforu podczas pasażowania? | EDTA chelatuje jony wapnia i magnezu, które są niezbędne w procesie przyczepiania się komórek do podłoża. |
| Jak zmienia się morfologia komórek podczas odklejania? | Stają się one okrągłe. |
| Jak zmienia się morfologia komórek podczas adhezji do podłoża? | Rozpłaszczają się. |
| Jaką funkcję pełnią antyoksydanty? Przykład | Np. glutation, B-merkaptoetanol czy DTT - jeśli komórki są inkubowane w atmosferze wzbogaconej w tlen, mogą powstawać wolne rodniki |
| Jaką funkcję pełni CMC? | Karboksymetyloceluloza jest dodawana do mediów, gdy hodowle w zawiesinie są poddane mieszaniu - CMC zwiększa lepkość i zapobiega mechanicznemu zniszczeniu komórki |
| Jaką funkcję pełnią środki selekcyjne? | Np. genetycyna - antybiotyki które stosuje się przy uzyskiwaniu stabilnych klonów komórek transfekowanych jakimś wektorem/zainfekowanych jakimś wirusem w celu nadekspresji/wyciszania ekspresji danego GOI. |
| Jaką funkcję pełnią media kondycjonowane? | Są to pożywki zebrane znad innych komórek i podane komórkom docelowym. |
| Dlaczego oznaczania ilościowego aktyny nie można wykonać za pomocą przeciwciał? | Nie można zrobić np. Western Blota, dlatego, że to na powie tylko ile jest całkowitej aktyny, a nie o stosunku F- do G-aktyny. ELISA, cytometria przepływowa, immunocytochemia podobnie. |
| Dlaczego tak ciężko zmierzyć ilość F-aktyny? | Są to bardzo różne filamenty: krótciutkie, rozgałęzione, etc. Dodatkowo w każdej komórce jest 6 izoform aktyny. |
| Zasada oznaczania aktyny - Reakcja 1 | Enzym DNAza I może być zahamowana przez aktynę (w stosunku 1:1) - wyhamowuje tylko monomeryczna aktyna (aktyna G). Po reakcji mierzymy DNA przy 260 nm. |
| Zasada oznaczania aktyny - Reakcja 2 | Aktynę F należy rozłożyć do formy monomerycznej za pomocą rozcieńczenia buforem A (który ma ATP i Ca2+ - stabilizują formę G) i oznaczyć DNAzę I - oznaczamy aktynę całkowitą (Aktynę T). Po odjęciu AT od AG otrzymujemy AF. |
| Dlaczego ważne jest aby znać stosunek aktyny F-G? | Może to być marker nowotworowy, np. w komórkach czerniaka zmienia się stosunek F-G. |
| Próba badana w oznaczaniu aktyny | Cytozol + DNAza + DNA + HCLO4 (inaktywacja DNAzy) - wytrąca się niestrawione DNA (mierzymy DNA przy 260 nm) |
| Próba kontrolna w oznaczaniu aktyny | DNAza + DNA + HCLO4 (inaktywacja DNAzy) - wytrąca się niestrawione DNA (mierzymy DNA przy 260 nm) - bez cytozolu! |
| Próba tła w oznaczaniu aktyny | Cytozol + DNAza + HCLO4 (bez DNA, DNA dodajemy dopiero inaktywacji enzymu) |
Created by:
biotech6