Help
Options
Question
Parametry kinetyczne
click to flip
Didn't know it?
click below
click below
Knew it?
click below
click below
Don't know
Question
Stała Michaelisa
Remaining cards (61)
Know
retry
shuffle
restart
0:00
Embed Code - If you would like this activity on your web page, copy the script below and paste it into your web page.
Normal Size Small Size show me how
Normal Size Small Size show me how
Enzymologia - ĆW
Skrypt
| Question | Answer |
|---|---|
| Parametry kinetyczne | KM, kcat, kcat/KM |
| Stała Michaelisa | KM, określa stężenie substratu przy, którym szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę wartości szybkości maksymalnej (1/2 Vmax). |
| Stała szybkości reakcji | kcat - opisuje zdolność enzymu do katalizowania reakcji chemicznych. Inaczej, określa liczbę cząsteczek substratu przetworzonych przez cząsteczkę enzymu w czasie jednej sekundy, w warunkach, w których enzym wykazuje maksymalną aktywność. |
| Stała specyficzności reakcji | kcat/KM |
| BApNA | Nα-Benzoilo-DL-Arginylo-p-Nitroanilid |
| Od czego zależą parametry kinetyczne? | Parametry kinetyczne reakcji katalizowanych enzymatycznie są charakterystyczne dla danej pary enzym – substrat i warunków prowadzenia reakcji. |
| Jak wyznacza się parametry kinetyczne? | Dokonujemy pomiaru szybkości początkowej reakcji enzymatycznej w funkcji stężenia substratu v = f([BApNA], w warunkach: 1. dużego nadmiaru substratu w stosunku do enzymu ([BApNA]>>[E0]) 2. przy stałym stężeniu enzymu ([E0] = constant) |
| Po co wyznacza się parametry kinetyczne? | Wyznacza się je w celu porównania zdolności katalitycznych różnych enzymów i/lub podatności różnych substratów na katalizę. |
| Dlaczego szybkość reakcji enzymatycznej maleje w miarę jej trwania? | Z powodu wyczerpywania się substratów, a także w niektórych przypadkach hamowania aktywności enzymu przez produkty reakcji, reakcje przebiegające w przeciwnym kierunku lub postępującą inaktywację enzymu. |
| Trypsyna - test enzymatyczny | Trypsyna w obojętnym lub lekko zasadowym środowisku efektywnie przyspiesza hydrolizę BApNA do N-benzoilo-DL-argininy i barwnej p-nitroaniliny (pNA), której ilość oznacza się spektrofotometrycznie przez pomiar absorpcji światła o długości fali 405 nm. |
| Jak oznaczana jest początkowa szybkość reakcji enzymatycznej? | Początkowa szybkość reakcji enzymatycznej (v0) jest wyznaczana jako przyrost ilości jednego z produktów reakcji np. p-nitroaniliny (pNA) w czasie: v = Δ{pNA}/ Δt. |
| Od czego zależy stała Michaelisa? | Jej wielkość zależy od rodzaju substratu, pH i temperatury. |
| O czym świadczy niska stała Michaelisa? | Jej wartość jest miarą powinowactwa enzymu do substratu. Im niższa wartość KM tym powinowactwo enzymu do substratu jest wyższe. |
| Jak wyznacza się kcat? | Wyznacza się ją jako iloraz prędkości maksymalnej i stężenia enzymu: kcat = Vmax/[E0] (jednostka: µM/s/µM = 1/s). |
| Jak wyznaczyć KM? | Należy przeprowadzić serię reakcji enzymatycznych, wykorzystując wzrastające stężenia [S]. Do każdej z reakcji wyznaczyć szybkość początkową Vo, dalej przedstawić na wykresie zależność Vo od S. Do otrzymanych punktów dopasować krzywą, wyznaczyć Km i Vmax. |
| Czy enzym można zamrażać i rozmrażać? | Tak. Ważne jest przechowywanie na lodzie, aby nie doszło do deaktywacji. |
| Dlaczego nie można przechowywać substratów na lodzie? | Ponieważ są rozpuszczone są w DMSO, ponowne włożenie do lodu spowoduje ich zestalenie. |
| Jak wyznacza się stężenia aktywnej trypsyny? | Polega na miareczkowaniu centrów aktywnych trypsyny za pomocą wybuchowego, syntetycznego, drobnocz. substratu NPGB. Ilość wolnego p-nitrofenolu w roztworze wyznaczana przy 410 nm jest miarą ilości aktywnych cząsteczek enzymu w tym samym roztworze. |
| Acyloenzym | Przejściowy kowalencyjny kompleks enzymu z substratem. |
| NPGB | nitrofenylo-4-guanidyno-benzoesan |
| Jak przebiega reakcja enzymatyczna trypsyny z NPGB? | Enzym szybko tworzy z NPGB acyloenzym i hydrolizuje w. estrowe uwalniając tylko barwny p-nitrofenol, podczas gdy II część substratu (guanidyno-benzoesan) wolno zwalnia się z acyloenzymu blokując kieszeń wiążącą przed dostępem kolejnej cz. substratu. |
| Jak wyznacza się stężenie substratu? | Poprzez całkowitą hydrolizę porcji roztworu substratu z wykorzystaniem trypsyny. Miarą stężenia substratu (BApNA) jest różnica A405 przed dodaniem odpowiedniej ilości trypsyny do kuwety z niewielką zawartością BApNA i po całkowitej jego hydrolizie. |
| Jaki warunek musi zostać spełniony, aby doszło do całkowitej hydrolizy substratu? | Gdy spełniony zostanie warunek [E] > [S] |
| Jak można zapobiec wypadaniu substratu z r-ru? | Bufor reakcyjny nie może zawierać detergentów (np. Tritonu), powinien zawierać do kilku procent DMSO, należy bardzo energicznie wymieszać zawartość kuwety po dodaniu roztworu substratu. |
| Kiedy substrat może wypadać z r-ru? | Przy wyższych stężeniach. |
| Wzór na stałą asocjacji | Ka = [EI] / [E] × [I] |
| Wzór na stałą inhibicji | (odwrotność stałej asocjacji) Ki = [E] × [I] / [EI] |
| Stała asocjacji | Stała równowagi tworzenia kompleksy enzym-inhibitor kompetycyjny |
| Stała inhibicji | Stała równowagi reakcji rozpadu kompleksy enzym-inhibitor |
| Jak wyznacza się stałą asocjacji? | Do każdej kuwet z r-rem enzymu o stałym, znanym stężeniu [E0] w b. reakcyjnym dodajemy wzrastających porcji r-ru inhibitora. Następnie w celu wykazania akt. wolnego E do każdej z kuwet dodać należy tej samej porcji substratu i zarejestrować Vo reakcji. |
| Jak można upewnić się, że układ enzym-inhibitor jest w stanie równowagi chemicznej? | Należy inkubować enzym z inhibitorem w buforze reakcyjnym przez czas (tink) około dziesięciokrotnie dłuższy od czasu połówkowego (t1/2) tworzenia kompleksu EI – tink = 10 × t1/2. |
| Czym różni się trypsyna od chymotrypsyny? | Trypsyna tworzy trwały acyloenzym, a chymotrypsyna nietrwały. |
| Jak przebiega reakcja enzymatyczna chymotrypsyny z NPGB? | Substrat NPGB tworzy z enzymem nietrwały acyloenzym. Rozkłada się on dużo szybciej niż w przypadku miareczkowania trypsyny, dlatego po dodaniu chymotrypsyny do kuwety obserwujemy wzrost A410. |
| PMSF | fenylometylosulfofluorek |
| TLCK | tozylolizynochlorometyloketon |
| Jak działają nieodwracalne drobnocząsteczkowe inhibitory? | Reagują z reaktywnymi grupami (np.: -OH, -NH2, -SH) łańcuchów bocznych reszt aminokwasowych tworząc nieodwracalne, kowalencyjne kompleksy (bardziej lub mniej trwałe) modyfikują właściwości białek w tej liczbie enzymów. |
| BPTI | Jest inhibitorem kompetycyjnym proteaz serynowych, do których należy chymotrypsyna. |
| PMSF i TLCK | Organiczne związki chemiczne, będące inhibitorami proteaz serynowych. |
| Dlaczego chymotrypsyna jest słabo hamowana przez TLCK w porównaniu z trypsyną? | Ma mniejszą kieszeń katalityczną w centrum aktywnym niż trypsyna, dlatego dostęp do znajdującej się tam seryny dla TLCK trudniejszy. |
| Dlaczego PMSF hamuje tak samo dobrze trypsynę i chymotrypsynę w porówaniu z TLCK? | PMSF jest mniejszą cząsteczkę niż TLCK i dostęp do centrum aktywnych obu enzymów jest łatwiejszy. |
| Czy inhibitory kompetycyjne zwiększają wartość Km? | Tak, powinowactwo enzymu do substratu się zmniejsza. |
| Czy inhibitory kompetycyjne są w stanie zmniejszyć maksymalną szybkość reakcji? | Nie. |
| Co jest cechą charakterystyczną proteaz serynowych? | Białka enzymatyczne tego rodzaju zawierają w centrum aktywnym serynę i histydynę będące dawcą ładunku dodatniego. Mają serynę w triadzie katalitycznej. |
| Czy trypsyna charakteryzuje się szeroką specyficznością substratową? | Nie. |
| Jak działa trypsyna? | Katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych w miejscach, w których grupy karbonylowe należą do argininy albo lizyny. |
| Czy wszystkie enzymy posiadają triady katalityczne? | Nie. Nie muszą być to triady. |
| Triada katalityczna | Trzy reszty aminokwasowe które bezpośrednio lub pośrednio biorą udział w reakcji chemicznej z substratem - są to niezbędne reszty aminokwasowe dla zajścia reakcji. Znajdują się w centrum katalitycznym enzymu. |
| Triada katalityczna chymotrypsyny | Asp, His i Ser |
| Triada katalityczna trypsyny | His57, Asp102, Ser195 |
| Co jest istotą katalizy enzymatycznej? | Zmniejszenie energii aktywacji, efektem czego jest przyspieszenie reakcji nawet 10^7x. |
| Czy kM zależy od stężenia enzymu i substratu? | Analizując równanie Michaelisa-Menten można dojść do wniosku, iż przy stałym stężeniu enzymu, szybkość reakcji w pewnych granicach zależy od stężenia substratu. Km nie zależy natomiast od stężenia enzymu. |
| W jakiej jednostce wyrażana jest Km? | dm3 |
| Do czego wykorzystuje się nieodwracalne inhibitory enzymów? | Do mapowania miejsca aktywnego enzymu. |
| Proteazy serynowe - przykłady | Trypsyna, chymotrypsyna, elastaza |
| Jaki jest sens działania enzymów? | Enzymu jako biologiczne katalizatory szybko i efektywnie przesuwają równowagę danej reakcji w kierunku jej produktów. |
| Co aktywuje trypsynogen do trypsyny? | Autoaktywacja lub enterokinaza działająca w dwunastnicy. |
| Gdzie wydzielana jest trypsyna? | W trzustce. |
| Dlaczego w przygotowaniu krzywej kalibracyjnej konieczne jest aby znać dokładne stężenie AKTYWNEGO enzymu? | W przypadku enzymów oznaczenie jedynie stężenie białka jest niewystarczające, ponieważ część enzymu może być nieaktywna. |
| W jakim miejscu przeprowadza hydrolizę trypsyna? | W miejscach, w których grupy karbonylowe należą do argininy albo lizyny - R lub K |
| W jakim r-rze należy przechowywać trypsynę? | W takim, żeby się sama nie strawiła - 20mM CaCl2,1mM HCl (pH 3) |
| Jakie warunki musi spełniać bufor do oznaczania aktywności trypsyny? | CaCl2 (np 20mM) - chroni przed samotrawieniem, pH - 8, niezbędne do zachowania aktywności. |
| Jak łączy się BPTI z trypsyną? | Poprzez pętlę wiążącą proteinazę, która zawiera resztę Lys15 inhibitora idealnie dopasowaną do kieszeni wiążącej substrat w cząsteczce enzymu. |
Created by:
biotech6