Help
Options
Didn't know it?
click below
click below
Knew it?
click below
click below
Don't Know
Remaining cards (0)
Know
retry
shuffle
restart
0:00
Embed Code - If you would like this activity on your web page, copy the script below and paste it into your web page.
Normal Size Small Size show me how
Normal Size Small Size show me how
TBM - W6
| Question | Answer |
|---|---|
| Czym są biblioteki DNA? | Zestawy klonów DNA (genetycznie odrębny osobnik lub grupa organizmów identycznych genetycznie). Każdy z klonów powstał poprzez włączenie do wektora innego fragmentu DNA, który następnie został namnożony w komórkach gospodarza. |
| Czym jest biblioteka genomowa? | Źródłem DNA jest genomowy DNA. Fragmenty DNA reprezentują cały genom organizmu. |
| Czym jest biblioteka cDNA? | Źródłem DNA jest mRNA. Fragmentu DNA reprezentują geny kodujące białka (bez intronów). |
| Jakiej biblioteki użyjemy, jeśli chcemy otrzymać sekwencję promotora? | Genomową. |
| Jakiej biblioteki użyjemy, jeśli chcemy ekspresjonować białko? | cDNA. |
| Jakiej biblioteki użyjemy, jeśli chcemy otrzymać określić miejsca intronów w genie? | Należy porównać sekwencje otrzymaną z genomowej i cDNA biblioteki. |
| Jak przebiega wybór wektora do biblioteki genomowej? | Małe genomy mogą być klonowane na wektorze plazmidowym, większe w wektorach lambda, kosmidach, YAC i BAC. |
| Jak przebiega wybór wektora do biblioteki cDNA? | W większości przypadków mRNA, a zatem i cDNA są względnie krótkie (0.5-10Kpz). Do klonowania stosowane mogą być wektory plazmidowe i wektory pochodne faga lambda. |
| Jak przebiega konstrukcja biblioteki genomowej? | 1. Izolacja DNA genomowego. 2. Fragmentacja DNA. |
| Jak przebiega fragmentacja DNA? | Albo mechaniczne rozrywanie albo trawienie enzymami restrykcyjnymi. |
| Jak przeprowadza się częściowe trawienie DNA? | Przy trawieniu enzymami restrykcyjnymi, modulując czas trawienia i stosunek enzymu do DNA. |
| contig | Zbiór nakładających się sekwencji. |
| Po co przeprowadza się częściowe trawienie? | Umożliwia to otrzymanie dłuższych fragmentów niż w przypadku całkowitego trawienia, umożliwia utworzenie nakładających się (overlapping) klonów. |
| Jaka jest biblioteka reprezentatywna (genomowa)? | Powinna zawierać wszystkie sekwencje zawarte w genomie. Im większa wielkość insertów, tym biblioteka może zawierać mniej klonów. |
| Jak przebiega konstrukcja biblioteki cDNA? | 1. Izolacja mRNA, 2. Sprawdzenie integralności mRNA, 3. Synteza cDNA 4. Obróbka końców dsDNA, 6. Ligacja z wektorem |
| Jak przebiega izolacja mRNA w konstrukcji biblioteki cDNA? | Wybiera się odpowiednią tkankę i warunki wzrostu organizmu - mRNA nie jest jednakowe w każdej komórce, zmienia się w zależności od tkanki, stanu fizjologicznego, warunków w jakim znajduje się organizm. |
| Jak przebiega sprawdzenie integralności mRNA w konstrukcji biblioteki cDNA? | Np. elektroforeza w żelu agarozowym lub akrylamidowym - mRNA tworzy rozciągniętą smugę od 0,5kpz-10kpz lub w bioanalizatorze. |
| Jakie rodzaje starterów używa się do bibliotek cDNA? | OligodT, przypadkowe i specyficzne do genu. |
| Jakie są wady i zalety startera oligodT? | Zaleta: specyficznie przyłącza ogon PoliA mRNA w całkowitej puli preparatu. Wada: Biblioteka nie będzie zawierała wystarczającej ilości danych dla genów kodujących. |
| Jakie są wady i zalety startera przypadkowego? | Zaleta: generuje dużą liczbę sekwencja reprezentatywnych biblioteki cDNA, wady: produkty cDNA mogą był mały, matryce z poliA są faworyzowane. |
| Jakie są zalety i wady startera specyficznego do genu? | Zaleta: biblioteka cDNA jest wzbogadzona o sekwencje ORF, Wada: bliblioteka cDNA tego typu ma ograniczone zastosowanie |
| Jak przebiega obróbka końców dsDNA w konstrukcji biblioteki cDNA? | Przyłączenie linkerów: końce dwuniciowego cDNA wyrównywane są na "tępo" DNA polimerazą Pfu, do tępych końców cDNA przyłączane są linkery EcoRI. |
| Jak przeszukiwane są bibioteki DNA w poszukiwaniu interesującego nas genu? | Metoda hybrydyzacji, wykrywanie białka. |
| Na czym polega metoda hybrydyzacji? | Sonda znakowana, komplementarna do poszukiwanej sekwencji. |
| Na czym polega metoda wykrywania białka? | Można wykryć białko, które jest produktem klonowanych fragmentów DNA (przeciwciała, aktywność). |
| Jakie są metody sekwencjowania DNA? | Metoda Sangera (tzw. metoda dideoksy) |
| Na czym polega metoda Sangera? | Metoda ta wykorzystuje właściwości dideoksynukleotydów. Przyłączenie dideoksynukleotydu do nowo syntetyzowanego DNA hamuje wydłużanie nici, z powodu braku grupy OH w pozycji 3’ pentozy, niezbędnej do utworzenia wiązania fosfodiestrowego |
| Czym jest sekwencjonowanie? | Sekwencjonowanie jest odczytywaniem kolejności nukleotydów w genomie. Pozwala na poznawanie struktury i funkcji genów, szukanie mutacji oraz zrozumienie molekularnych mechanizmów ewolucji. |
| Czym są dideoksynukleotydy? | Nukleotydy nieposiadające grupy hydroksylowej, a jedynie wodór w pozycjach 2’ i 3’ cukru. |
| Co może być matrycą w metodzie dideoksy? | Jedynie jednoniciowy DNA. |
| Jakie są etapy metody Sangera? | 1. Przyłączenie starterów dla polimerazy DNA (komplementarne do matrycy oligonukleotydy), dzięki którym enzym może rozpocząć syntetyzowanie komplementarnej nici DNA. 2. Dodanie dNTP i ddNTP (dideoksynukleotydów). |
| Jaka musi być polimeraza do metody Sangera? | Wysoka procesywność, która pozwala na oddysocjowanie nici dopiero po całkowitym zakończeniu jej syntezy, czyli przyłączeniu się ddNTP, brak aktywności egzonukleazy 5’ → 3’, brak aktywności egzonukleazy 3’ → 5’, |
| Dlaczego polimeraza do metody Sangera nie może mieć baktywności egzonukleazy 5'-3'? | Gdyż usuniecie nukleotydów z końca 5’ nowosyntetyzowanego łańcucha skróciłoby go, uniemożliwiając właściwe odczytanie sekwencji. |
| Dlaczego polimeraza do metody Sangera nie może mieć aktywności egzonukleazy 3'-5'? | Dzięki temu polimeraza nie może usunąć dideoksynukleotydów kończących łańcuch. |
| Jaką polimerazę stosuje się do metody Sangera? | Początkowo fragment Klenowa pochodzący z polimerazy DNA I E.Coli, aktualnie polimeraza DNA z faga T7. |
| Co decyduje o tym, kiedy zakończy się przerwanie syntezy DNA w metodzie Sangera? | Przypadek, oznacza to, że każda probówka zawiera miliony cząsteczek analizowanego DNA i każda ulega kopiowaniu, więc w probówkach pojawiają się łańcuchy o wszelkich możliwych długościach (zależnych od sekwencji matrycy). |
| Jak analizuje się wyniki sekwencjonowania metodą Sangera? | Elektroforeza w denaturującym żelu poliakrylamidowym. W celu wizualizacji produktów reakcji stosowane są znaczniki radioaktywne lub fluorescencyjnie. Sekwencje odczytuje się od dołu do góry w czterech kanałach osobnym dla każdego nukleotydu. |
| Na czym polega sekwencjonowanie automatyczne? | Każdy dideoksynukleotyd jest wyznakowany innym fluorochromem, więc do odczytania pełnej sekwencji badanego DNA wystarczy jedna reakcja z zastosowaniem wszystkich ddNTP. Wydruk - sekwencja w postaci serii szczytów, gdzie jeden szczyt - jeden nukleotyd. |
| Jak analizuje się wyniki sekwencjonowania automatycznego? | Detektor posiada zdolność rozróżnienia poszczególnych znaczników, więc elektroforezę prowadzi się na jednej ścieżce w żelu poliakrylamidowym, a sekwencja może być odczytywana bezpośrednio w trakcie przesuwania się prążków przed detektorem. |
| Czym jest elektroforeza kapilarna? | Oba końce kap. zanurzone są w zasobnikach z odpowiednimi elektrolitami. Sama kap. wypełniona jest swobodnym elektrolitem lub porowatym nośnikiem. Do obu końców kap. przykłada się wysokie napięcie co skutkuje pojawieniem się we wnętrzu kap. p. elektrycz. |
| Jak używa się elektroforezy kapilarnej w sekwencjonowaniu? | Nukleotydy znakowane fluorescencyjnie będą się wydostawały z kapilary zgodnie z wielkością. Laser UV sprawdza długość fali emisji światła z kropel wydobywających się z kapilary. Aż 96 próbek może przechodzić przez 96 kapilar. |
| Jak przbeiega sekwencjonowanie nowej generacji? | 3 etapy: pierwszym z nich jest izolacja i stworzenie biblioteki DNA, kolejnym amplifikacja matrycy, zaś ostatnim masowe równoległe sekwencjonowanie. |
| Na czym polega sekwencjonowanie nowej generacji? | Metody NGS opierają się o równoległe, masowe sekwencjonowanie od kilku tysięcy do kilkuset milionów różnych matryc – tzw. bibliotek. |
| Metody wchodzące w sekwencjonowanie nowej generacji | Pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie mostkowe, sekwencjonowanie typu Ion Torrent, sekwencjonowanie SOLID (przez ligację fluorescencyjnie znakowanych krótkich oligonukleotydów) |
| Ile jest sekwencji kodujących w naszym genomie? | 2% |
| Czym jest biologia systemów? | Podejście naukowe oparte na badaniach typu "omika" w celu zrozumienia globalnego procesu biologicznych zachodzących w organizmach. Zajmuje się badaniem złożonych oddziaływa występujących w systemach biologicznych. |
| Jak sekwencjonuje się RNA? | Za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. |
| Czym jest RNA-seq? | RNA sequencing inaczej WTSS czyli whole transcriptome shotgun sequencing. |
| Po co sekwencjonuje się RNA? | Aby ujawnić ilość i jakość RNA w próbce biologicznej w danym momencie. Używa się go, aby analizować stale zmieniający się transkryptom. |
| Czym są mikromacierze? | Zestaw sond cDNA (60-70nt)/oligonukleotydów (25nt), rozlokowanych regularnie na stałym podłożu (szkło, plastik) w określonych pozycjach, zdolnych do hybrydyzacji z komplementarnymi fragmentami DNA lub RNA. |
| Jaka jest różnica między hybrydyzacją a mikromacierzami? | Główna techniczną różnicą między tradycyjnymi technikami hybrydyzacyjnymi a systemami mikromacierzy polega na odwróceniu ról sondy i próby. W analizach mikromacierzy duża liczba sond związanych z podłożem jest hybrydyzowana ze znakowaną próbą badaną. |
| Jak wykrywa się sygnał z mikromacierzy? | Za pomocą skanera DNA. Zróżnicowanie kolorów barwników, którymi znakuje się próby umożliwia bezpośrednie porównywanie ze sobą mRNA z tkanki normalnej i zmienionej. |
| Jak przebiega analiza na mikromacierzach? | 1. Sonda na mikropłytce. 2. Inkubacja płytek z roztworem znakowanego barwnikami fluoryzującymi cDNA lub cRNA (próba). 3. Etap hybrydyzacji 4. Wzbudzenie światłem. 5. cDNA lub cRNA emitują światło proporcjonalne do ilości zhybrydyzowanej próby. |
| Co jest sondą w mikromacierzach? | Na mikropłytkach związane są setki/tysiące jednoniciowych fragmentów DNA odpowiadających różnym genom. |
| Co jest próbą w mikromacierzach? | Wyizolowany mRNA, cDNA lub cRNA cRNA- produkt transkrypcji in vitro uzyskany na matrycy cDNA. |
| Co jest ważne w mikromacierzach? | Zarówno kontrola jak i próby są znakowane. |
| Jakie są wady mikromacierzy? | Musimy znać sekwencje aby zaprojektować mikromacierz. Nawet jak znamy sekwencje, to nie możemy umieścić wszystkich genów. Kohybrydyzacja powoduje fałszywe sygnały . Brak linearności. |
Created by:
biotech4