Help
Options
Didn't know it?
click below
click below
Knew it?
click below
click below
Don't Know
Remaining cards (0)
Know
retry
shuffle
restart
0:00
Embed Code - If you would like this activity on your web page, copy the script below and paste it into your web page.
Normal Size Small Size show me how
Normal Size Small Size show me how
TBM - ÄW4
Oczyszczanie wstawki i wektora, ligacja, transformacja
| Question | Answer |
|---|---|
| Czym jest ligacja? | Łączenie dwóch cząsteczek kwasu nukleinowego za pomocą enzymu ligazy. |
| Jakie występują rodzaje ligaz? | Ligazy DNA i RNA. |
| Jak działają ligazy DNA? | Katalizują tworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy grupą fosforanową 5’P oraz grupą 3’OH deoksyrybozy cząsteczki DNA przy wykorzystaniu energii pochodzącej z hydrolizy ATP. |
| Jaka jest najczęściej używana ligaza DNA? | Ligaza z faga T4. |
| Jak działa ligaza z faga T4? | Enzym ten bierze udział w ligacji fragmentów restrykcyjnych DNA zawierających „lepkie“ bądź „tępe“ końce. |
| W jakiej temperaturze jest przeprowadzana ligacja końców lepkich? | 12-15°C |
| W jakiej temperaturze jest przeprowadzana ligacja końców tępych? | 25-30°C |
| Czym różni się ligacja końców lepkich o ligacji końców tępych? | Ligacja końców tępych wymaga wyższej temperatury (25-30°C) i wymaga od 10 do 100 razy większej ilości enzymu. |
| Jaka działa ligaza z komórek E.Coli? | Łączy fragmenty restrykcyjne o homologicznych lepkich końcach. W przeciwieństwie do ligazy T4, jako kofaktora wymaga NAD. |
| Czym różni się ligaza z faga T4 od ligazy z E.Coli? | Ligaza E.Coli wymaga jako kofaktora NAD a T4 ATP. |
| Kiedy używamy ligazy z komórek E.Coli? | Enzym ten może być alternatywnie używany w stosunku do ligazy T4, w sytuacji gdy produkty restrykcji nie posiadają tępych końców. |
| Jak działają ligazy RNA? | Katalizują zależną od ATP reakcję tworzenia wiązania fosfodiestrowego pomiędzy grupą fosforanową 5’P jednoniciowej cząsteczki DNA lub RNA oraz grupą 3’OH jednoniciowej cząsteczki DNA lub RNA. |
| Jakie wymagania musi spełnić reakcja, aby ligacja przebiegła prawidłowo? | Brak zanieczyszczeń, takich jak składniki reakcji PCR, które mogą hamować aktywność ligazy, a także odpowiednia ilość cząsteczek wstawki w stosunku do ilości wektora. |
| Jaki powinien być stosunek ilości cząsteczek wstawki do ilości wektora? | Reakcja ligacji zachodzi najefektywniej, gdy ilość cząsteczek wstawki jest trzykrotnie większa od ilości wektora (stosunek 3:1). |
| Jak oblicza się ilość wstawki potrzebnej do reakcji ligacji? | x = 3 x (l wstawki ⁄ l wektora) × m wektora , gdzie l oznacza odpowiednio długość wstawki i wektora, a m to ilość (masa) wektora użytego do ligacji. |
| Czym jest transformacja? | Proces transformacji bakterii polega na wprowadzeniu zrekombinowanego (posiadającego insert), bądź niezrekombinowanego (nie zawierającego insertu) plazmidu do komórek gospodarza. |
| Jakie organizmy posiadają naturalną zdolność kompetencji? | Bakterie i drożdże. |
| Co to znaczy, że organizm jest kompetentny? | Zdolny do przyjęcia DNA. |
| Jakich organizmów używa się do transformacji? | Bakterii kompetentnych, np. E.Coli. |
| Po co używa się E.Coli w transformacji? | W celu uzyskania różnych konstruktów plazmidowych. |
| Jak można uzyskać bakterie kompetentne? | Zakupić bakterie kompetentne (za drogie) albo wykonać je samodzielnie w laboratorium. |
| Jakie występują rodzaje transformacji? | Elektroporacja, metoda wykorzystująca środki chemiczne, lipofekcja, metoda wykorzystująca węglik krzemu, metoda biolostyczna, mikroiniekcja, elektrotransformacja. |
| Na czym polega elektroporacja? | Metoda ta polega na poddaniu komórki działaniu silnego pola elektrycznego (1.25-2.5 kV) przez bardzo krótki okres czasu (kilka milisekund) w wyniku czego w błonie komórkowej powstają pory umożliwiające wnikanie do wnętrza komórki cząsteczek DNA. |
| Kiedy używa się elektroporacji? | Metoda ta wykorzystywana jest do transformowania komórek bakterii, zwierząt oraz lub protoplastów roślin i grzybów. |
| Na czym polega metoda wykorzystująca środki chemiczne? | Metoda ta wykorzystuje środki chemiczne, które zwiększają przepuszczalność błony. Stosowane środki znajdują się w roztworze wraz z DNA. |
| Przykłady zastosowania metody z wykorzystaniem środków chemicznych. | Transfekcja protoplastów roślinnych za pomocą glikolu polietylenowego, chemiczna transformacja bakterii za pomocą chlorku rubidu lub chlorku wapnia. |
| Na czym polega lipofekcja? | Polega na zamknięciu cząsteczek DNA w liposomach (pęcherzykach fosfolipidowych), które następnie miesza się z komórkami gospodarza. Liposomy łączą się z błoną komórkową wprowadzając do wnętrza komórki swoją zawartość. |
| Kiedy stosuje się lipofekcję? | W przypadku komórek nie posiadających ściany komórkowej i jest najczęściej stosowana do transformacji komórek zwierzęcych. |
| Na czym polega metoda transformacji wykorzystująca węglik krzemu? | Do roztworu DNA dodawana jest zawiesina ostrokrawędzistych, mikroskopijnych kryształków węglika krzemu. Energiczne wytrząsanie w takiej zawiesinie komórek bakteryjnych lub protoplastów roślinnych ułatwia przenikanie DNA do ich wnętrza. |
| Na czym polega metoda biolostyczna? | Polega na wstrzeliwianiu cząsteczek DNA opłaszczonych na mikrokuleczkach (zwykle złota), za pomocą specjalnego urządzenia (tzw. „działa genowego”) do komórek gospodarza. |
| Kiedy stosuje się metodę biolostatyczną? | Wykorzystuje się ją do transformacji komórek o dużych rozmiarach, na przykład komórek roślinnych i zwierzęcych. |
| Na czym polega mikroiniekcja? | Wstrzykiwanie DNA do komórki biorcy lub bezpośrednio do jej jądra za pomocą szklanej kapilary. |
| Kiedy stosuje się mikroiniekcję? | Do komórek zwierzęcych. |
| Na czym polega elektrotransformacja? | Metoda polega na zastosowaniu prądu stałego o niewielkim napięciu (np. 50V), działającego przez kilkanaście minut. W tej metodzie DNA wprowadzane jest więc do komórek na zasadzie elektroforezy. |
| Kiedy używa się elektrotransformację? | Do transformowania roślin. |
| Od czego zależy wydajność transformacji E.Coli? | Transformacja E. coli zachodzi z niską częstością i zależy od rodzaju DNA: najwyższą wydajność uzyskuje się dla DNA plazmidowego w formie CCC (superzwinięta), niższą dla formy OC (kolista), a najniższą dla formy liniowej. |
| Ile cząsteczek wnika do jednej komórki bakteryjnej? | Tylko jedna cząsteczka DNA. |
| Jaka jest wydajność transformacji E. coli plazmidami w formie CCC? | 10^5-10^9 transformantów na 1 μg DNA. |
| Od jakich czynników zależy wydajność transformacji E. coli plazmidami w formie CCC? | Od szczepu bakterii, rodzaju kom. kompetentnych, związków chem. używanych do wymuszania kompet., fazy wzrostu kom., ilości i wielkości DNA, czasu inkubacji DNA z komórka, czasu trwania szoku term., czystości odczynników i szkła oraz jakości pożywki. |
| Jakie są rodzaje komórek kompetentnych? | Chemi- i elektrokompetentne. |
| Dlaczego należy przeprowadzać selekcję transformantów? | Selekcję przeprowadza się by wyodrębnić bakterie, które przyjęły wektor, a w wśród nich te z wektorem zrekombinowanym. |
| Czym jest wektor zrekombinowany? | Posiadający wstawkę. |
| Jak przeprowadza się selekcję zrekombinowanych plazmidów w pierwszym etapie? | Wykorzystuje się markery selekcyjne. Wysianie transformowanych bakterii na pożywkę selekcyjną zawierającą antybiotyk kompatybilny z genem oporności, skutkuje wzrostem jedynie tych komórek, które przyjęły wektor. |
| Jaka jest ogólna funkcja markerów selekcyjnych? | Nadają komórkom bakteryjnym określone właściwości. |
| Jak działa gen odporności na tetracyklinę tet'? | Koduje białko związane z błoną komórkową, które zabezpiecza przed dostaniem się antybiotyku do wnętrza komórki. |
| Jak działa gen odporności na ampicylinę amp'? | Koduje enzym katalizujący hydrolizę pierścienia β- laktamowego w przestrzeni peryplazmatycznej komórek bakteryjnych, dzięki czemu umożliwia degradację antybiotyku. |
| Jak działa gen odporności na chloramfenikol Cm' lub cat? | Koduje cytoplazmatyczne białko katalizujące formację pochodnych chloramfenikolu, które nie posiadają możliwości wiązania się z rybosomami, dzięki czemu dochodzi do zaburzenia syntezy białek w komórce. |
| Jak działa gen odporności na kanamycynę i neomycynę npt II? | Ekspresja genów powoduje powstanie fosfotransferazy kanamycyny (neomycynowa fosfotransferaza II), która inaktywuje transport antybiotyków do wnętrza komórki. |
| Jakie są sposoby przeprowadzania selekcji zrekombinowanych plazmidów w drugim etapie? | Poprzez wykorzystanie markera II do wykrywania transformantów ze zrekombinowanym plazmidem, selekcja na białe-niebieskie, markery selekcyjne/geny selekcyjne, stosowanie genów zabójczych dla komórki. |
| Czym są geny selekcyjne? | Geny kodujące białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. |
| Na czym polega selekcja z wykorzystaniem markera II do wykrywania transformantów ze zrekombinowanym plazmidem? | Metoda opiera się na obecności w plazmidzie II-go markera selekcyjnego, w obrębie którego tnie się restryktazą, co umożliwia wprowadzenie wstawki. Powoduje to zniszczenie g. markerowego. Bakt. posiadające zrekomb. plazmid będą wrażliwe na antybiotyk. |
| Jaki jest przebieg selekcji z wykorzystaniem markera II? | Poszczególne kolonie wykazujące wzrost pod względem pierwszego markera selekcyjnego (np. ampicyliny) przenosi się na pożywkę zawierającą drugi marker selekcyjny (na. tetracyklinę). |
| Co oznacza brak wzrostu kolonii podczas selekcji z wykorzystaniem markera II? | Brak wzrostu oznacza, że dana kolonia posiada plazmid zrekombinowany, gdyż w wyniku rozerwania ciągłości genu tet', transformanty nie wykazują oporności na ten antybiotyk. |
| Jaka działa β–galaktozydaza? | Aktywna β-galaktozydaza działa jako oligomer, zbudowany z 4 identycznych łańcuchów polipeptydowych. Każdy polipeptyd może być podzielony na dwa, osobno nieaktywne, fragmenty: α (N-koniec; lacZα) i ω (C-koniec polipeptydu, lacZΩ ). |
| Jaki powinien być przygotowany plazmid do selekcji na białe-niebieskie? | Powinien zawierać N-końcowy fragment genu lacZ (nazywany fragmentem lacZ’ lub α) wraz z sekwencją promotorową. |
| Jak powinien być przygotowany szczep bakteryjny do selekcji na białe-niebieskie? | Powinien zawierać część C-końcową (nazywana fragmentem lacZΩ lub ω), wraz z sekwencjami niezbędnymi dla jej ekspresji. |
| Jaki enzym jest wykorzystywany w selekcji na białe-niebieskie? | β–galaktozydaza (enzym katalizujący laktozę, kodowany przez gen lacZ), która rozkładając bezbarwny substrat (X-Gal) tworzy produkt o niebieskiej barwie. |
| Jakich związków dodaje się do pożywki w selekcji na białe-niebieskie? | β–galaktozydazę, X-Gal, IPTG. |
| Jaką funkcję pełni IPTG? | Indukuje ekspresję aktywności β–galaktozydazy w komórkach E. coli. |
| Jaki jest przebieg selekcji na białe-niebieskie? | Po wprowadzeniu plazmidu do komórki bakteryjnej, produkty białkowe obydwu fragmentów genu lacZ łączą się tworząc funkcjonalny enzym. |
| Jak wyglądają kolonie zawierające plazmid zrekombinowany w selekcji na białe-niebieskie? | Będą białe, gdyż z powodu rozerwania ciągłości fragmentu lacZ' w komórce nie będzie powstawał aktywny enzym – nie dojdzie do rozkładu zawartego w podłożu X-Gal. |
| Jak wyglądają kolonie zawierające plazmid niezrekombinowany w selekcji na białe-niebieskie? | Będą niebieskie, gdyż brak wstawki umożliwi powstanie części lacZα, która wraz z częścią lacZΩ, stworzy funkcjonalny enzym rozkładający X-Gal do produktu o niebieskiej barwie. |
| Kiedy β–galaktozydaza jest aktywna? | Enzym będzie aktywny, jeżeli w komórce jednocześnie z fragmentem ω będzie syntetyzowany peptyd α. |
| Czym jest α-komplementacja? | Proces, w którym produkty białkowe obydwu fragmentów genu lacZ (lacZ' i lacZΩ) łączą się tworząc funkcjonalny enzym. |
| Jaka jest zaleta selekcji na białe-niebieskie? | Identyfikacja bakterii, które pobrały wektor i bakterii, które pobrały wektor zrekombinowany jest możliwa na jednym etapie. |
| Jakie jest ograniczenie selekcji na białe-niebieskie? | Ograniczeniem jest stosowanie tylko wybranych plazmidów i szczepów bakterii (np. DH5α) oraz stosunkowo wysoki koszt składników selekcyjnych podłoża X-Gal i IPTG. |
| Jaka jest funkcja markerów selekcyjnych I? | Markery selekcyjne I umożliwiają identyfikację komórek zawierających dany wektor, bowiem hamują wzrost komórek niestransformowanych. Szczep użyty do transformacji musi być wrażliwy na dany antybiotyk! |
| Jaka jest funkcja markerów selekcyjnych II? | Pozwala na odróżnienie wektora zrekombinowanego (zawierającego wklonowaną wstawkę) od takiego, który jest „pusty” tj. nie zligował się z żadnym fragmentem DNA. |
| Na czym polega metoda z użyciem genów zabójczych dla komórki? | Metoda ta opiera się na użyciu wektora posiadającego gen, którego produkt jest toksyczny dla komórki bakteryjnej. Do powstania produktu takiego genu dochodzi w komórkach, które pobrały podczas transformacji pusty, niezrekombinowany wektor. |
| Jakich genów używa się w metodzie z użyciem genów zabójczych dla komórki? | Np. gen dla enzymu restrykcyjnego. Gdy komórki posiadają wektor niezrekombinowany, syntetyzowany jest enzym restrykcyjny, który niszczy komórkę. Kom. bakteryjna, która pobrała zrekombinowany wektor będzie w stanie się namnażać, bo produkt nie powstaje. |
| Jakie kolonie będą rosły na pożywce przy użyciu genów zabójczych dla komórki? | Kolonie posiadające wyłącznie zrekombinowane plazmidy. |
| Co jest ograniczeniem metody z użyciem genów zabójczych dla komórki? | Niewielki wybór dostępnych plazmidów. |
| Jak ocenia się stężenie trawionych produktów? | Poprzez rozdział w żelu agarozowym oraz pomiar spektrofotometryczny (NanoDrop). |
| Jaka jest długość produktu PCR po cięciu enzymami HindIII i XbaI? | Ok. 600 pz. |
| Dlaczego przed transformacją zalecane jest odbiałczenie mieszaniny ligacyjnej lub termiczna inaktywacja ligazy? | Bo ligaza jest enzymem toksycznym dla komórek E. coli |
| Jak inaktywuje się ligazę? | Inkubacja w 65°C przez 10 min. |
| Po co wysiewa się nietransformowane bakterie chemikompetentne? | Kontrola czystości, sprawdzenie, czy antybiotyk w podłożu nie uległ rozkładowi. |
| Na czym polega metoda heat shock? | Metoda transformacji komórek bakteryjnych polegająca traktowaniu bakterii zimnym CaCl2 (na lodzie) i szybkim podgrzaniu do 42°C. |
Created by:
biotech4